《沉水植物绿羽毛狐尾藻组织培养体系的建立》
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摘 要 以小二仙草科观赏沉水植物绿羽毛狐尾藻（Myriophyllum hippuroides Nutt.ex Torr.& A.Gray）茎段为外植体,比较升汞、次氯酸钠在不同浓度、不同处理时间下对外植体灭菌效果的影响;以MS为基本培养基,研究不同质量浓度配比的6-BA和NAA对芽诱导和生根培养的影响.结果表明,外植体最佳消毒方式为70%乙醇（20 s）+无菌水冲洗4次+0.1%升汞（结合吐温80）,消毒5 min;最适合芽诱导的培养基为MS+0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA,诱导率为89.2%;最适合根诱导的培养基为MS+0.30 mg/L NAA,生根率达100%.
关键词 绿羽毛狐尾藻;沉水植物;组织培养;再生体系
中图分类号 S682.32 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2020）10-0068-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.10.019
Abstract The stem segments of ornamental submerged plant Myriophyllum hippuroides were used as explants,with different concentrations of mercuric chloride and sodium hypochlorite in different processing time on explants,and the sterilization effects were compared by different disinfection methods.The effects of different ratio concentration of 6BA and NAA on adventitious bud induction and rooting culture were studied with stem segment as explants and MS as media.The results showed that the optimal way to sterilization for explants was 70% ethyl alcohol（20 s）+sterile water washing 4 times+0.1% HgCl2（with Tween80）for 5 min.The most suitable medium for bud induction was MS+0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA,the inducation rate reach 89.2%;the most suitable medium for root induction was MS+0.30 mg/L NAA,the rooting rate could reach 100%.
Key words Myriophyllum hippuroides;Submerged plant;Tissue culture;Regeneration system
沉水植物作為淡水生态系统的重要成员,在维持水生态系统结构和功能的稳定以及园林造景方面发挥重要作用.近年来,由于水体污染严重,导致河流沉水植物群落退化或消失,造成淡水生态系统的功能丧失[1].沉水植物可防治水体富营养化,具有很好的脱氮除磷效果[2],是水生植物群落重建与恢复的基础和关键,因此沉水植物的引种成为水生植被恢复工程的首要环节.沉水植物主要以无性繁殖为主[3],短时间内从异地采集种苗会遇到种源不足和采集地生态环境破坏等问题,而利用组织培养快繁技术可以解决这一问题.绿羽毛狐尾藻（Myriophyllum hippuroides Nutt.ex Torr.& A.Gray）为小二仙草科狐尾藻属多年生沉水植物,原产美洲,为水族造景常用植物,具有较高的观赏价值和一定水体净化能力.因此,绿羽毛狐尾藻组织培养体系的建立,为沉水植物组织培养技术研究提供参考,对营建人工湿地景观和水生植被恢复重建具有重要意义.
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验所用绿羽毛狐尾藻（Myriophyllum hippuroides Nutt.ex Torr.& A.Gray）购于水族市场,以长势良好的幼嫩茎段作为外植体.
1.2 培养条件
试验以MS培养基为基本培养基（含蔗糖20 g/L、琼脂6 g/L,pH 5.8）,分别添加不同浓度配比的6-BA和NAA,并于121 ℃高压灭菌20 min.培养温度为（24±1）℃,光强2 000 lx,光照时间为12 h/d.
1.3 试验方法
1.3.1 外植体的处理.
取长势良好的绿羽毛草幼嫩植株,用洗衣粉浸泡20 min,自来水冲洗植株1 h,剪去叶片,用蒸馏水冲洗4遍.
1.3.2 外植体不同消毒方法的筛选.
将已经处理好的外植体置于超净工作台,采用不同消毒方式进行处理,初步清洗后的外植体采用70%乙醇表面消毒20 s,无菌水冲洗4遍,再分别用0.1%升汞或次氯酸钠消毒（0.1%升汞结合吐温-80,处理时间分别为3、5、7 min;1%次氯酸钠,处理时间分别为3、5、7 min;2%次氯酸钠,处理时间分别为3、5、7 min）,不同处理见表1.消毒处理后用无菌水冲洗4遍,用无菌滤纸吸干多余水分,切取2 cm左右带节茎段,接种到培养基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA.每个处理接种30个外植体,重复3次.培养15 d后,统计污染率等于污染外植体数/接种的外植体总数×100%,死亡率等于死亡的外植体数/接种的外植体总数×100%,存活率等于存活的外植体数/接种的外植体总数×100%.
1.3.3 芽诱导培养基的筛选.
选取已经灭菌完成的外植体,切取2 cm左右带节茎段,接种到芽诱导培养基上.培养基为MS+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L,pH 5.8,并添加0.25～2.00 mg/L 的6-BA及0.10～0.20 mg/L的NAA,以无激素培养基为对照,共设置9个处理,每个处理接入30个茎段,每个处理重复3次.置于培养室中培养,培养28 d后,统计不定芽数量和芽长,计算芽诱导率,诱导率等于诱导出芽的外植体数/接种的外植体数×100%.
1.3.4 生根培养基的筛选.
为了研究不同浓度激素对根诱导的影响,将芽诱导培养基中长势良好的芽苗在无菌条件下转入生根培养基（MS+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L+NAA,NAA含量为0.10～0.30 mg/L）.每个处理接入20棵芽苗,设置3个重复,21 d后统计生根情况,根诱导率等于诱导生根的芽苗数/接种的芽苗数×100%.
1.4 数据分析 试验数据均表示为平均值±标准差,采用Excel 2007和SPSS 20.0软件进行处理和统计分析.
2 结果与分析
2.1 不同消毒处理对外植体灭菌效果的影响
消毒剂的浓度和处理时间不同,外植体的灭菌效果不同,不同消毒处理间存在较显著差异（P<0.05）.从表1可以看出,在9种消毒处理中,0.1% 升汞结合吐温-80处理5 min,污染率较低,为11.82%,外植体死亡率为21.11%,存活率可达67.07%,吐温作为表面活性剂,可以使升汞与外植体表面充分接触,消毒效果较好;当处理时间达到7 min时,外植体无法存活,死亡率较高.次氯酸钠消毒处理总体上比0.1%升汞效果要差,随着次氯酸钠浓度增加、处理时间延长,污染率降低,但外植体存活率下降明显,试验中发现用2%次氯酸钠处理7 min,外植体褐化严重,导致死亡.研究表明消毒剂处理时间短,灭菌不彻底,处理时间长则会破坏植物组织,导致外植体死亡,综合考虑污染率和存活率,最佳灭菌方式为0.1%升汞结合吐温-80,处理5 min.
2.2 不同激素浓度配比对芽诱导培养效果的比较
从表2可看出,6-BA和NAA不同浓度组合使芽数增加显著高于对照组（P<0.05）.当6-BA和NAA浓度较低且浓度配比值低时,可在茎段茎节处长出侧芽.培养基中添加0.25 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA时,芽苗生长较快,但较细弱（图1A）.当添加0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA时,芽诱导率最高,可达89.20%,芽苗呈深绿色,长势良好（图1B）.当添加0.50 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA时,生长调节物质浓度较低,此时在茎段基部形成愈伤组织,从愈伤组织上长出芽苗,芽苗较短（图1C）.随着生长调节物质浓度增加,在茎段基部形成愈伤组织,长出的芽苗又会分蘖出侧芽,芽苗长势良好（图1D）.
2.3 不同激素对根诱导培养效果的比较 将诱导生成的芽苗转接到生根培养基上,在MS基本培养基中只添加NAA,芽苗生长情况见表3.接种7 d时有芽苗开始生根,21 d时0.30 mg/L NAA的培养基生根率达到100%,平均根长为7.59 cm（图2A）.MS培养基中添加0.10 mg/L NAA时生根缓慢,培养21 d时根诱导率仅为66.67%,可见生长素的含量对根的形成有较大影响.
3 讨论与结论
沉水植物为了适应水体生态环境而发生组织结构改变,表皮细胞壁薄,无角质层或角质层很薄,使得消毒剂通透性增强[4],在灭菌的同时,对植物组织伤害较大,灭菌条件较难控制,因此,常用于陆生植物的消毒方法对沉水植物并不適用.升汞杀菌的原理是Hg2+可与带负电荷的蛋白质结合,使蛋白质变性,酶失去活性;而次氯酸钠的杀菌作用主要是次氯酸的氧化作用,不仅可与细胞壁发生作用,还可浸入细胞内与蛋白质发生氧化作用,使细胞糖代谢失调而死亡[5],吐温作为表面活性剂,可以使灭菌更加彻底,外植体染菌率低,成活率高,在对红腺忍冬（Lonicera hypoglauca）[6]和卫矛（Euonymus alatus）[7]外植体消毒过程中吐温和升汞的结合为外植体消毒的最佳方法,与该试验的结果相似.
植物组织培养中,不定芽诱导常用的激素为6-BA和NAA[8],该研究发现激素浓度低且6-BA与NAA质量浓度比小于10∶1时,外植体茎节处长芽,由于激素含量低,芽苗较为细弱;当激素浓度升高且6-BA与NAA质量浓度比值超过10∶1时,茎段基部会形成愈伤组织,愈伤组织进一步分化形成芽苗,可见芽苗诱导效果既受到6-BA和NAA的浓度影响,同时还受到2种激素浓度比值的影响.从愈伤组织诱导途径获得植株个体,存在变异,不利于母本的特性保留[9],综合考虑得出该研究最适合芽诱导的培养基为MS+0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA,诱导率达89.20%.
诱导芽苗生根时加入的NAA对根诱导具有促进作用[10],随着NAA浓度的增加,芽苗的生根率及生长速度都有显著增加,该研究最适合的根诱导培养基为MS+0.30 mg/L NAA,培养21 d的生根率高达100%,平均生根数为4.5条.
该试验从外植体灭菌、芽诱导培养基、根诱导培养基的筛选3个方面研究了沉水观赏植物绿羽毛狐尾藻的组织培养离体快繁技术,此技术能够短期内培育出大量种苗,可用于水体环境修复,因其为水族造景常用植物,其经济意义不言而喻.
参考文献
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植物和组织培养引用文献:
[1] 植物和组织培养毕业论文提纲范文 植物和组织培养类在职毕业论文范文10000字
[2] 植物组织培养和植物论文范本 植物组织培养和植物相关论文范本8000字
[3] 植物组织培养和植物论文范文集 植物组织培养和植物类有关论文范文检索2000字
