有关水稻Ds插入淡绿叶突变体的鉴定和遗传毕业论文写作资料-论文写作网

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突变体水稻论文范文

随着水稻基因组测序计划的完成[1,2】,以研究水稻基因功能为核心的水稻功能基因组学成为当前和今后很长一段时间内植物基因组研究中的热点.突变体是遗传学研究的基础材料,也是基因组研究的重要材料,而叶色变异是其中较常见的一种表型变异.在基础研究中,叶色突变体是研究植物光合作用、光形态建成、激素生理以及抗病机制等一系列生理代谢过程的好材料[3】.

利用转座子插入诱变的方法被认为是进行大规模基因功能鉴定的有力工具之-【4】.近年来,利用玉米Ac/Ds系统已建立了多个水稻突变体库[5~9],并已筛选出一些水稻突变体[10~17].本研究在水稻的Ac/Ds双元件转座系统中[18],筛选到一个叶色突变体,该突变体在三叶期由绿色转为淡绿色,Ds转座检测表明Ds转座与突变表型共分离.1材料和方法1.1材料

通过水稻Ds-T-DNA转化纯合体和Ac-T-DNA转化纯合体的杂交,我们构建了水稻的Ac/Ds双元件转座系统【18】.利用上述材料,从中筛选到一个淡绿叶突变体,该突变体对光敏感,强光致死,弱光下可缓慢生长.本研究所用各世代材料田间种植在华南农业大学教学实验农场；室内种植在光照培养室中,采用弱光照条件(50—150 umol quanta/m2.s).1.2方法1.2.1 Ds转座的PCR检测

Ds转座的PCR检测参照Liu等[18]的方法.Ds因子切离的PCR检测利用引物Pl0(5’-TCCCGT CCGA论文范文TCGAC论文范文TA-3’)、Tra4(5’-TAGCTCACTCA论文范文AGGCACCC-3’)和P5(5’-AAGCTCAAGCTGCTCTAGCA论文范文CG-3’)同时扩增.如果Ds未发生切离,称为满载供体位点(Full donor site,FDS),通过引物Pl0和P5可以扩增出约400 bp的特异带；如果Ds从T-DNA上切离,称为空载供体位点(Empty donorsite,EDS),引物Tra4和P5可以扩增出约870 bp的特异带：如果既存在EDS又存在FDS．则利用3条引物可以同时扩增出两条特异带.1.2.2叶绿素荧光参数的测定

叶绿素荧光参数的测定采用FMS-I脉冲调制式荧光仪（英国Hansatech公司）进行活体测定,按照仪器使用说明书进行操作.盆栽,两周后测定,5次重复,然后计算其平均值.测定之前样品预先黑暗处理20min.测定的主要参数有：Fo,初始荧光(Minimalfluorescence)是PS II反应中心处于完全开放时的荧光产量,它与叶片叶绿素浓度有关,也能反映PSII的受损情况；Fm,最大荧光产量(Maximal fluorescence)是PS II反应中心处于完全关闭时的荧光产量,可反映通过PS II的电子传递情况；Fv等于Fm-Fo,可变荧光(Variable fluorescence)反映了QA的还原情况：Fv/Fm,是PS II最大光化学量子产量(Optimal/maximal quan-tum yield ofPSII)反映PSII原初光能转化效率,不受物种和生长条件的影响,在非胁迫条件或非突变条件下该参数的变化极小,胁迫或突变条件下该参数明显下降,是植物是否发生光抑制的可靠指标[|9.20]2结果与分析2.1 突变体表型及遗传分析

本研究通过水稻Ds-T-DNA转化纯合体和Ac-T-DNA转化纯合体的杂交,构建了水稻Ac/Ds双元件转座系统[18].利用上述材料筛选突变体时,发现来自d6xB5-9-14-4和d6xB5-9-14-6的两个株系在三叶期有一些绿苗转为淡绿色苗,鉴于突变体在幼苗后期才呈现显著的叶色变异,暂将突变体命名为lpgl(late pale-green leal).在这两个株系中,野生型和突变植株数分别为442和1 30株,卡方测验表明野生型和突变体的分离比符合3：I(X2等于 1.46<,X20.05.3 l等于3.84) -野生型表型单株收获播种,后代有2/3的株系发生性状分离,说明该突变是单基因控制的隐性突变.在自然光照下,突变体播种20—25d后,由绿苗转为淡绿色并迅速焦枯（图1 A）,但是在弱光照条件下(50～150 umol quanta/m2.s),突变体能缓慢生长至开花(图lB,C).2.2 突变体lpgl光合作用特性

为了研究突变体的光合作用特性,我们测定了突变体的叶绿素荧光参数（表1）.突变体的Fo(平均.值141.50)约是中花I1(75.25)的两倍,表明突变体的光合机构可能已遭破坏；而突变体lpgl的Fv/Fm(0.66)较对照(0.85)明显降低,说明该淡绿叶突变体lpgl是典型的光抑制突变体2.3突变性状与转座的Ds之间的关系

利用引物Pl0、Tra4和P5同时扩增,对突变体及其后代分离群体做了Ds转座的PCR检测.结果表明,检测植株存在3种基因型(图2): Ds转座杂合类型植株既存在FDS又存在EDS,能同时扩增出约400 bp和约870 bp的两条特异带,这些植株的Ds因子其中一个发生了转座,但同时又保留了一个未转座的Ds因子(图2,泳道1和2), Ds转座纯合类型植株只能扩增出约870 bp的EDS特异带(图2,泳道3),这些植株的Ds因子均已发生转座；Ds未转座类型植株只能扩增出约400 bp的FDS特异带（图2,泳道4和5）,这些植株的Ds因子仍然在T-DNA上,未发生转座.M: DNA 100 bp Marker,l,2：转座杂合体,既存在EDS又存在FDS,3：转座纯合体,仅存在EDS:4,5：Ds未转座植株,仅存在FDS._

水稻突变体库:突变体_1

为了分祈突变体表型与转座的Ds之间的关系,对突变体的表型和转座类型进行了综合分析（表2）.在Ti代的2个分离群体中,共检测200株,Ds未转座类型(EDS-FDS+)45株,Ds转座杂合类型(EDS+FDS+)95株,Ds转座纯合类型(EDS+FDS-)60株,三者之间的比率符合1：2：l(X2等于 0.46<,X20.05.2等于 5.99).在株系d6xB5-9-14-4中,绿苗分为两种类型：Ds转座杂合类型(EDS+FDS+)49株,Ds未转座类型(EDS-FDS+)21株,两者比率接近2:1；突变体全部属于Ds转座纯合类型(EDS+FDS-)共33株.在株系d6xB5-9-14-6中,绿苗分为两种类型：其中Ds转座杂合类型(EDS+FDS+) 46株,Ds未转座类型(EDS-FDS+)24株,两者比率接近2:l；淡绿叶苗27株为Ds转座纯合类型(EDS+FDS-).在T2代的3个分离群体中,共检测663株,154株突变型植株均为Ds转座纯合类型,509株野生型植株中350株为Ds转座杂合类型,其余为Ds未转座类型,三者之间的比率同样符合1：2：l(X2等于 2.14<,X20.Os,2等于5.99).根据上述结果可以认为,淡绿叶突变体的产生是由于转座的Ds插入所引起的.3讨论

随着水稻基因组测序的完成,如何利用水稻基因组中大量的序列信息去阐明基因的生物学功能,是目前所面临的迫切任务和巨大挑战.在各种功能基因组学研究方法中,利用T-DNA或转座子的插入诱变的方法被认为是进行大规模基因功能鉴定的有力工具[4].转座子插入法构建水稻突变体库始于20世纪80年代末,利用玉米Ac/Ds系统已建立了多个水稻突变体库[5—91.目前,已有8例用Ac/Ds转座系统成功分离水稻基因的报道,其中的两个基因(abf71和fzp)属同一位点[10—17].通过水稻Ds-T-DNA转化纯合体和Ac-T-DNA转化纯合体的杂交,我们构建了水稻的Ac/Ds双因子转座系统[18].利用上述材料,从中鉴定到一个叶色突变,Ds转座检测表明Ds转座与突变表型共分离（表2）.由于Ds插入序列是已知的,可以作为插入位点的分子标签,利用各种克隆策略鉴定该基因.

根据叶色突变体的研究结果,推测其发生机制主要有以下几种观点：叶绿素生物合成途径中的基因突变；血红素一光敏色素生色团生物途径中基因突变；编码其它叶绿体蛋白的基因突变；与光合系统无直接关系基因突变.迄今,国内外已经报道了大约80个水稻叶绿素突变有关基因(http://www.shigen.nig.ac.j p/rice/o ryzabase/gene s/geneClasses.j sp),部分基因的功能已有研究.Jung等[21]在研究水稻白化苗时发现,控制突变性状的Os CHLH基因编码镁螯合酶的最大亚基CHIH,T-DNA的插入使CHIH亚基缺失了C末端,由于C末对时CHIH亚基的活性有很大影响,因此C末端的缺失导致酶活性降低,从而导致该突变体叶绿素的合成受阻.Sugimoto等[22]对一个淡绿色突变研究发现,由于突变体在叶绿体形成过程中,质体转化受阻而影响叶绿体正常合成.Gothandam等[23]利用RNAi的方法研究了与叶绿体发生相关的基因OsPPRI,该基因沉默导致水稻叶子白化.Agrawa]等l24]研究发现由于ABA生物合成途径中的基因突变,直接抑制ABA的合成,导致ABA含量下降,从而影响突变体的生长发育,造成叶色突变.近来,Wu等[25]报道了一个水稻黄绿叶突变体ygll,该突变体前期叶片为论文范文,中期慢慢转绿,后期叶色接近野生型,与野生型相比,ygll突变体有较高光合效率和较强的耐受光抑制能力.基因功能研究表明,YGL1基因编码叶绿素合成酶,催化叶绿素合成过程中最后一步叶绿素a的形成.与黄绿叶突变体ygll相比,淡绿叶突变体lpgl三叶期前叶色几乎与野生型无差异,三叶期后突变体迅速变为淡绿色：且突变体对光敏感,在自然光照下仅能在幼苗期存活,但是在弱光照条件下,突变体能缓慢生长至开花（图1）.从突变体上述表型推测,lpgl可能与叶绿素合成无直接关系,而与植物在强光下的耐受性有关.

当叶片吸收光能过多,不能及时有效地加以利用或耗散时,植物就会遭受强光胁迫,引起光合能力降低,发生光合作用的光抑制,光抑制涉及光保护和光破坏两方面,主要表现为PSII的光化学效率和光合效率的降低.植物光合作用的光抑制是一个极其复杂的生物过程,光保护机制涉及叶黄素循环,光呼吸,LHCII的磷酸化,活性氧清除系统的保护作用等多方面[26].Holt等[27]通过转基因拟南芥的研究证实类胡萝卜素阳离子的形成需要玉米黄质存在,并与去激发反馈调节相藕连,结果表明能量从叶绿素分子转到叶绿素一玉米黄质二聚体后发生电荷分离,是植物强光下多余能量释放的去激发反馈调节机制.虽然植物体中存在许多种光保护机制,但光抑制的过度发生,造成光合机构的破坏是不可避免的.Ohnishi等[281确立了Psn光破坏的两步机制：第一步发生在放氧复合体,第二步发生在光化学反应中心.叶绿素荧光参数研究表明,lpgl突变体耐受光抑制能力显著减弱（表1）,光抑制的过度发生,可能造成突变体lpgl光合机构破坏,叶绿素降解而呈现叶色变异,但是具体机制有待进一步研究.

植物光合作用的光抑制分子机理的研究已取得了一些重要进展,但要阐明光抑制的机理还要做很多工作,对有关基因功能的研究有待深入.本研究中的DS插入突变是一个纯合致死的叶色突变,对光敏感,是典型的光破坏抑制受阻突变体,对其功能进行研究将会有助于对光合作用机制研究的深入.

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