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猪背最长肌中胰岛素样生长因子(IGFs)系统基因的发育表达模式
顾以韧1, 张凯1, 李明洲1, 李学伟1, 朱砺1, 王金勇2, 陈磊2
1. 四川农业大学动物科技学院, 雅安 625014,
2. 重庆市畜牧科学研究院, 荣昌 402460
摘 要: 采用荧光定量PCR技术检测了长白猪和梅山猪的背最长肌组织中胰岛素样生长因子1和2(IGF-1和-2)、胰岛素样生长因子1受体和2受体(IGF-1R和-2R)、胰岛素样生长因子结合蛋白3和5(IGFBP-3和-5)基因mRNA丰度在初生(0月龄)、1、2、3、4和5月龄间的表达变化并分析品种间和不同月龄间基因表达的差异及其对肌肉生长发育的影响.结果表明: 两猪种出生后IGF-1 mRNA表达量均表现为逐渐上调, 而IGF-2则恰好相反, 表现为逐渐下调.这与IGF-2主要在胚胎期发挥作用, 而IGF-1则主要在动物个体出生后才发挥促进细胞增殖和个体发育功能的特点相符.IGFRs mRNA与IGFs mRNA 表达的发育性变化模式并不相似, 提示背最长肌组织中IGFRs mRNA 的表达可能没有受到组织局部产生的IGFs调节.长白猪的IGF-1R、IGF-2R 和IGFBP-3 mRNA表达量均在2月龄时达到最高峰, 提示2月龄可能是长白猪IGFs系统发挥作用最为明显的生长发育阶段.以上结果初步揭示猪生长发育过程中胰岛素样生长因子系统基因表达的发育性变化模式和品种差异, 为深入研究胰岛素样生长因子系统基因的相互调控机制提供了基础数据.
关键词: 猪, 背最长肌, 荧光实时定量PCR, 胰岛素样生长因子, 胰岛素样生长因子受体, 胰岛素样生长因子结合蛋白
Developmental expression changes of insulin-like growth factors (IGFs) system genes in longissimus dorsi muscle of two pig breeds
GU Yi-Ren1, ZHANG Kai1, LI Ming-Zhou1, LI Xue-Wei1, ZHU Li1, WANG Jin-Yong2, CHEN Lei2
1. College of Animal Science and Technology, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China,
2. Chongqing Animal Husbandry Institute, Rongchang 402460, China
Abstract: Real-time fluorescence quantitative PCR was applied to investigate the developmental expression patterns of insulin like growth factor-1 and -2 (IGF-1 and -2), insulin like growth factor receptor -1 and -2 (IGF-1R and -2R), insulin like growth factor binding protein-3 and -5 (IGFBP-3 and -5) genes at the age of birth (0), 1, 2, 3, 4, and 5 months in longissimus dorsi muscle of Landrace and Meishan pigs. The expression level of IGF-1 exhibited up-regulation, in contrast, the expression level of IGF-2 showed down-regulation after birth in the two pig breeds. These findings are consistent with the previous knowledge that IGF-2 is mainly expressed during the embryonic phase, IGF-1 is mainly expressed during the postnatal period, which could promote cell proliferation and ontogenesis. The expression patterns of IGFRs and IGFs were dissimilar from 0 to 5 months in the two pig breeds, which suggest that the expression changes of IGFRs may not be subjected to the regulation by local secretion of IGFs. Strikingly, at the age of 2 months, the expression levels of IGF-1R, IGF-2R, and IGFBP-3 reached their maximum peak values in Landrace pigs, which suggest that the 2 months after birth may be the most important growth stage for genes of insulin-like growth factors (IGFs) system to exert their biological functions from birth to 5 months. These results indicate that the mRNAs of IGFs system genes exhibit specific developmental expression changes between Landrace and Meishan pigs, and provides some data for further study on the mutual regulation mechani论文范文 of genes in IGFs system.
Keywords: pig, longissimus dorsi muscle, QRT-PCR, insulin like growth factors (IGFs), IGF receptors (IGFRs), IGF binding proteins (IGFBPs)
IGFs系统由一组配体、受体和结合蛋白组成.配体包括胰岛素、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、胰岛素样生长因子2(IGF-2), IGF-1和IGF-2可促进细胞的有丝分裂和分化, 抑制细胞凋亡, 刺激DNA合成和细胞复制, 诱导G0期静止状态的细胞进入G1期, 推动细胞依次经历细胞周期的各个时期[1~3].相应受体为胰岛素受体、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)和胰岛素样生长因子2受体(IGF-2R), 其中, IGF-1R可分别与IGF-1和IGF-2结合, 但与IGF1的亲和力大于IGF-2, 而IGF-2R则与IGF-2的亲和力高于IGF-1.结合蛋白共6种, 即胰岛素样生长因子结合蛋白1~6(IGFBP1~6), 其可为位于细胞外和细胞外周间隙的IGFs提供特异结合位点并调节IGFs和相应受体之间的相互作用.该系统对胚胎、神经、骨骼肌和骨骼的发育、细胞增殖和转化等具有极其重要的作用[4~7].肌肉的生长发育与IGFs系统基因的时空特异性表达密切相关[8~10], 但目前关于其发育表达模式的资料较少, 不同品种猪(Sus scrofa)和不同部位肌肉IGFs基因表达的发育性变化模式还有待进一步探讨, 对于IGFs、IGFRs和IGFBPs发育表达模式的研究, 将有助于了解动物生长过程中激素调控的本质.瘦肉型的长白猪和脂肪型的梅山猪分属西方现代猪种和我国地方品种, 两个品种在生长发育相关性状上存在明显表型差异, 是研究肌肉生长发育的理想动物模型.
本实验采用荧光定量PCR(QRT–PCR)技术研究猪背最长肌组织中IGF-1、IGF-2、IGF-1R、IGF-2R、IGFBP-3和IGFBP-5 mRNA丰度在不同品种和不同生长发育阶段的发育表达变化, 并分析品种间和不同月龄间基因表达的差异及其对肌肉生长发育的影响, 为研究IGFs系统基因表达的调控机制及如何在生产实践中调控猪生长发育提供理论依据.
1.材料和方法
1.1 实验动物及采样
分别选用长白猪和梅山猪作为瘦肉型和脂肪型猪种的代表, 设置初生(0月)、1、2、3、4和5月龄, 共6个等时间点进程, 随机分配4头(2♂, 2♀)相同品种的全同胞仔猪到每个月龄内用于取样和性状测定, 共计48头.所有实验猪于同一时间开始组建群体, 在相同条件下饲喂, 28 d断奶, 自由采食.实验猪在达到相应时间点当天进行屠宰, 屠宰前停食24 h, 自由饮水.屠宰后迅速采集倒数3~4肋骨间背最长肌样品浸泡于RNAlater(Qiagen公司)中70℃保存.
1.2 性状测定
1.2.1 肌内脂肪(Intramuscular fat, IMF)含量的测定
屠宰后采集倒数3~4肋骨间背最长肌样品10 g左右, 采用热浸提-油重法测定鲜肉IMF含量, 所用仪器为FOSS 2055型脂肪测定仪(Foss公司).
1.2.2 肌纤维面积(Average cross-sectional area of myo- fibres, CSA)测定
屠宰后采集倒数3~4肋骨间背最长肌样品, 用10%论文范文固定, 后采用TP 1020型组织脱水机和RM 2135型切片机(Leica公司)制作背最长肌样品的石蜡切片, 苏木精-伊红(Hematoxylin&,eosin , H&,E)染色后用显微成相系统(Nikon公司)采集代表性区域图像, 通过Image Pro-Plus 6.0显微图像分析软件(Media-Cybernetics公司)测定每个样品中100根肌纤维的面积.
1.3 QRT-PCR测定IGF-1、IGF-2、IGF-1R、IGF- 2R、IGFBP-3、IGFBP-5 mRNA
1.3.1 总RNA提取和反转录
肌肉样品的总RNA 按照TRIZOL Reagent (Invitrogen公司)的操作说明书提取, 用Bio-Rad 核酸蛋白检测仪测定浓度, 并经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性然后使用SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit(TaKaRa公司)进行cDNA 的合成.
1.3.2 PCR引物的设计与合成
引物由Primer3在线程序(http: //frodo.wi.mit.edu/)设计, 北京赛百盛基因技术有限公司合成, 信息见表1.
1.3.3 QRT-PCR
参照TaKaRa 制品的《B. PCR反应试剂》说明书的操作步骤, 进行荧光定量PCR.PCR反应体系为25 L: 12.5 L SYBR Premix E× TaqTM(2×), 0.5 L引物(10 mol/L), 2 L的cDNA模板.采用两步法进行荧光定量PCR的扩增.PCR 循环参数为: 95.0℃ 10 s, 95.0℃ 5 s, 60℃ 30 s, 循环40次, PCR扩增后进行熔解曲线分析, 温度以0.5℃/30 s的速率从55.0℃缓慢递增到95.0℃.每次每一板上设置用于作标准曲线的标准品、未知样品(各重复3次)和1个阴性对照.
1.4 数据统计与分析
采用相对定量解析方法, 选用肌肉组织中稳定表达的看家基因ACTB、TBP和TOP2B, 根据iQTM5 Multicolor Real-Time PCR Detection System分析软件计算的拷贝数, 运用GeNorm软件计算出看家基因的归一化因子NF值(Normalization factor), 以目的基因mRNA的拷贝数(最大拷贝数设为1)与对应样品的NF值的比值表示基因mRNA的相对表达 量[11].采用SAS 9.1.3软件对性状指标和基因相对表达量进行最小二乘均数分析和多重比较, 结果以平均值±标准差(Mean±SD)表示.
2. 结果与分析
2.1 体重、IMF含量和CSA的生长发育变化
由图1可知, 长白猪的体重和肌纤维面积在绝大多数月龄上均稍高于梅山猪, 而IMF含量的变化趋势却相反, 从3月龄后梅山猪的IMF含量均明显
图1 长白猪和梅山猪体重、肌纤维面积和IMF含量的发育性变化
(a): 体重的发育变化, (b): 肌纤维面积的发育变化, (c): IMF含量的发育变化.高于长白猪, 且差距逐渐明显, 到5月龄时梅山猪的IMF含量为4.17%是长白猪(2.03 %)的2.05倍.
2.2 肌肉组织中IGF-1、IGF-2、IGF-1R、IGF-2R、IGFBP3和IGFBP-5 mRNA表达的发育性变化
由图2a可知, 长白猪和梅山猪的IGF-1 mRNA表达量总体呈现波动上升的趋势, 但梅山猪3月龄时急剧上调达到最高峰, IGF-1 mRNA表达量在两猪种内的各月龄间差异均达极显著水平(P&,lt,0.01), 且0、2、3和5月龄时品种间表达量差异达极显著水平(P&,lt,0.01).IGF-2 mRNA表达量(图2b)总体呈现出波动下降的趋势, 长白猪IGF-2 mRNA表达量除在2与4月龄间, 3与5月龄间未达显著水平(P&,gt,0.05)外, 其余各月龄间差异均达极显著水平(P&,lt,0.01), 梅山猪除3与4月龄间未达显著水平(P&,gt,0.05), 2与4月龄间达显著水平(P&,lt,0.05)外, 其余各月龄间差异均达极显著水平(P&,lt,0.01).品种间比较发现, 除0月龄时差异达显著水平外(P&,lt,0.05), 其余各月龄品种间差异均达极显著水平(P&,lt,0.01).
梅山猪IGF-1R mRNA表达量(图2c)的波动较为平缓, 而长白猪IGF-1R mRNA表达量表现为急剧上升至2月龄时达到最高, 此时mRNA表达量极显著高于其他各月龄(P&,lt,0.01), 随后波动下降至5月龄时为最低.品种间比较发现, 除1月龄时品种间表达量差异未达显著水平外(P&,gt,0.05), 其余各月龄品种间差异均达极显著水平(P&,lt,0.01).IGF-2R mRNA表达量(图2d)在两猪种背最长肌组织中均表现出明显的波动变化, 长白猪IGF-2R mRNA表达量在2月龄时极显著高于其他各月龄(P&,lt,0.01), 随后波动下降至5月龄时为最低.梅山猪IGF-2R mRNA表达量波动幅度较长白猪平缓, 在4月龄时为最高, 5月龄时为最低.品种间比较发现, 除3月龄时品种间差异未达显著水平外(P&,gt,0.05), 其余各月龄品种间差异均达极显著水平(P&,lt,0.01).
由图2e可知, 长白猪和梅山猪背最长肌组织中的IGFBP-3 mRNA表达量总体表现出先上调后下降的趋势, 但长白猪上调幅度远大于梅山猪, 以2月龄时的表达量为最高, 极显著高于其他各月龄(P&,lt,0.01), 梅山猪IGFBP-3 mRNA表达量在1月龄时为最高, 极显著高于其他各月龄(P&,lt,0.01).品种间比较发现, 除0和1月龄时品种间差异未达显著水平外(P&,gt,0.05), 其余各月龄品种间差异均达极显著水平(P&,lt,0.01).长白猪背最长肌组织中的IGFBP-5 mRNA表达量(图2f)表现为波动上升后下降的趋势, 梅山猪IGFBP-5 mRNA表达量表现为逐渐上调后下降的趋势.两猪种在4月龄时的表达量均达到最高, 极显著高于其他各月龄(P&,lt,0.01), 5月龄时表达量极显著下降(P&,lt,0.01), 但梅山猪在5月龄时下降的幅度明显高于长白猪.品种间比较发现, 除0月龄时品种间差异未达显著水平(P&,gt,0.05), 5月龄时品种间差异达显著水平外(P&,lt,0.05), 其余各月龄品种间表达量差异均达极显著水平(P&,lt,0.01).
3. 讨 论
梅山猪早熟易肥, IMF含量较高, 肉质优良, 但生长速度慢, 论文范文瘦肉率低(38.8%~45.0%), 属脂肪型猪种, 而长白猪IMF含量较低, 肉质较差, 但生长发育快, 饲料利用率高, 论文范文瘦肉率高, 是典型的瘦肉型猪种[12].本研究结果显示在体重和CSA指标上长白猪均较同月龄的梅山猪高, 但IMF含量却是梅山猪明显高于长白猪, 这与梅山猪和长白猪的种质特性相一致.
IGF-1和IGF-2都具有提高蛋白质合成中氨基酸的利用率并抑制蛋白质降解, 从而促进骨细胞和肌肉细胞的增殖的作用, 但其发挥作用的阶段存在差别.IGF-1对动物的生长发育起着十分重要的作用, 这种作用在出生后表现得尤为明显, 而IGF-2则主要在动物的胚胎期发挥作用, 胎儿的生长发育主要是受IGF-2的调节, 出生后IGF-2的功能逐渐被IGF-1代替[13~15].Gerrard等[16]用Northern blotting检测了怀孕30、44、5、68、75、89、109 d猪胎儿及21 d仔猪和180 d成年猪半腱肌中IGF-1和IGF-2 mRNA表达量变化, 结果显示: 从怀孕44 d开始半腱肌中IGF-1 mRNA表达量随胎龄增加而增加, 出生后进一步增加, 21日龄达到最高, 而IGF-2 mRNA表达量则以怀孕59 d时最高, 随后随胎(日)龄增加而减少, 成年时最低.Gtz等[17]通过免疫组化方法研究发现: 11~22周龄猪背最长肌中的IGF-1水平与血液中IGF-1的水平变化一致, 随年龄增加而升高.本研究结果显示两猪种IGF-1 mRNA表达量在0~5月龄间大体上表现为逐渐上调, 这与实验中得到的两猪种的性状发育性曲线趋势基本一致, 而IGF-2 mRNA的表达模式与IGF-1截然相反, 表现为逐渐下调.这与之前报道的IGF-2主要在胚胎期发挥作用, 而IGF-1则主要在动物个体出生后这个特殊的生理阶段才发挥促进细胞增殖和个体发育的生物学功能的观点相符.
IGF-1和IGF-2对细胞的作用绝大多数都是通过与IGF-1R结合而实现的, IGF-2R无信号转导功能, 仅为“清道夫”受体 (Sc论文范文enger receptor), 即主要功能是摄取和降解IGF-2.本研究结果显示梅山猪IGF-1R和IGF-2R mRNA表达量表现出波动起伏的表达模式, 两基因较为相似, 但IGF-2R的波动幅度略大于IGF-1R.而长白猪IGF-1R和IGF-2R mRNA表达量表现出先上调后波动下降的趋势, 两基因也较为相似, 均以2月龄时为最高, 5月龄时为最低.大量研究表明, IGFs的大部分促生长作用是由靶器官上的IGFRs介导的[18~20].2月龄时长白猪IGF-1R和IGF-2R mRNA表达量分别是梅山猪的1.79和2.78倍, 差异均达极显著水平(P&,lt,0.01), 而2月龄时长白猪的体重为11.97 kg极显著高于梅山猪的6.92 kg(P&,lt,0.01), 这与长白猪生长发育速度高于梅山猪的生物学表型相符合, 同时也提示长白猪2月龄时IGFRs基因mRNA的高丰度表达促进了其生长发育水平.IGFs的作用要通过IGFRs实现, 但本研究发现猪背最长肌组织中IGFRs mRNA 表达的发育性变化模式与IGFs mRNA 表达的发育性模式变化并不相似, 提示背最长肌组织中IGFRs mRNA 的表达可能没有受到组织局部产生的IGFs的调节, 推测可能与循环血液中IGFs的关系较大.
生长发育:蚕的生长发育
IGFs的作用受到IGFBPs的影响, IGFBPs具有延长IGFs的半衰期、调节IGFs的生物学活性、转运血浆中的IGFs和调节其在血液中的分配等作 用[21, 22].现已发现6种IGFBP, 每种IGFBP的表达与分布都受到严格精细的调控.肌肉组织中存在IGFBP-3、4、5和6, 其中以IGFBP-3和IGFBP-5为主[23].Grohmann等[24]研究发现青春期前儿童的骨骼肌中IGFBP-3含量比成年人高.而本研究中IGFBP-3 mRNA表达量在两猪种中都表现为先上调后下降的趋势, 且上调阶段的表达量均高于后期下降阶段的表达量, 这与Grohmann的研究是相符的.本研究还发现长白猪背最长肌中IGFBP-3 mRNA表达量在2月龄时急剧上调到最高, 而长白猪的IGF-1R和IGF-2R mRNA表达量在2月龄时同样为最高, 提示2月龄为在0~5月龄间长白猪IGFs系统发挥作用最为明显的生长发育阶段.肌肉组织中的IGFBP以IGFBP-5为最多[25], 但IGFBP-5对IGFs的作用是刺激性还是抑制性目前仍存在争论.Mukherjee等[26]通过对培育小鼠肌细胞的研究认为IGFBP-5的过表达可以通过抑制IGFs的作用而阻碍骨骼肌分化, 而这种作用可以通过增加IGF-1或IGF-2来克服[27, 28], 细胞所作出的生理反应可能取决于IGFBP-5和IGFs间的相对平衡.Oliver等[29]研究了3、5、10、20周龄老鼠后肢肌肉组织中IGFBP-5 mRNA的表达量变化, 发现IGFBP-5 mRNA表达量随年龄的增加而升高.而本研究结果显示IGFBP-5 基因在两猪种中表达模式相似, 均在4月龄时表达量达到最高后出现极显著下降, 且梅山猪的下降幅度明显高于长白猪, 这可能与梅山猪在4月龄后表现出强大的肌内脂肪沉积能力有关, 但其对相关性状的具体调控作用还有待于进一步研究.Ning等[30]研究发现同时缺失IGFBP-3和IGFBP-5的老鼠从出生后20 d开始出现明显的发育阻滞, 脂肪垫和股四头肌重量较成年鼠明显下降, 故推测IGFBP-3和IGFBP-5通过协同作用共同维持IGF-1对出生后老鼠生长发育的调控.本研究未发现长白猪和梅山猪背最长肌组织中的IGFBP-3和IGFBP-5 mRNA表达量变化对生长发育有显著的调控作用.IGFBP-5及其他IGFBPs对于决定细胞存活和死亡的特异功能以及其与IGFs间的精确关系仍有待于全面地揭示.
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