《粉红粘帚霉G019浅盘发酵工艺》
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摘 要为提高孢子产量,对粉红粘帚霉G-019浅盘发酵工艺进行了研究,开展了固态发酵基质和营养液成分的筛选以及含量的单因素试验.结果表明,最佳发酵工艺为：固态发酵基质为麸皮75%、玉米粉15%、啤酒糟10%,营养液为糖蜜2%、磷酸氢二钾0.15%、硫酸镁0.05%,料液比1∶1.在此条件下发酵10 d,孢子数可达1.07×1010 CFU/g.
关键词粉红粘帚霉;浅盘发酵;筛选;工艺优化
中图分类号TQ920.6文献标识码A
文章编号 1007-5739（2020）09-0092-03开放科学（资源服务）标识码（OSID）
AbstractIn order to improve the spore yield of Gliocladium roseum,the solid fermentation medium and nutrient solution were screened and the single factor experiment of the content were carried out.The results showed that the optimum fermentation conditions were as follows：75% bran,15% corn meal,10% brewer′s grains,2% molasses,0.15% potassium hydrogen phosphate,0.5% magnesium sulfate,material liquid ratio 1∶1.Under these conditions,the number of spores could reach 1.07×1010 CFU/g in 10 days.
Key wordsGliocladium roseum;shallow plate fermentation;screen;technique optimization
粉红粘帚霉（Gliocladium roseum）,属半知菌门丝孢纲丛梗孢目丛梗孢科粘帚霉属[1],是自然界一类重要的寄生菌,可寄生于植物和線虫活体内,也可作为腐生生物腐生长.粉红粘帚霉近年来在农业中的应用得到了广泛的开发,在植物线虫病[2]、灰霉病[3-6]、玉米基腐病[7]、林果枝干病[8]、水稻纹枯病[9]和黄瓜枯萎病[10]等的生物防治上表现出巨大的开发潜力.
本研究为降低成本、提高产量,采用浅盘发酵法,对固态基料、营养液的成分和含量进行了单因素筛选和优化,以期筛选出最优培养基配比,提高产孢量,为后续研究和工业化生产提供理论指导.
1材料与方法
1.1供试材料
1.1.1供试菌种.粉红粘帚霉G-019,为公司筛选、菌种库保存的菌种.
1.1.2试剂.硫酸铵、硝酸钠、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、氯化钙等,均为分析纯（AR）;蔗糖、葡萄糖、糖蜜、蛋白胨、酵母粉、琼脂,均为生化试剂级（BR）;稻壳、麸皮、木薯渣、秸秆粉、麦粒、玉米粉、木薯粉、豆饼粉、花生饼粉、啤酒糟等,均符合试验要求.
1.1.3仪器.电子天平、高压蒸汽灭菌锅、电加热干燥箱、恒温振荡培养箱、霉菌培养箱、生物显微镜、粉碎机.
1.1.4培养基.平板培养基为PDA培养基,液体菌种培养基为PDB培养基.
1.2试验方法
1.2.1菌种保存与活化.将菌种库甘油管菌种划线接种于PDA平板培养基上,在28 ℃条件下培养7 d;使用时用接种环挑取一环孢子接种于液体PDB培养基中,摇床28 ℃、转速160 r/min培养3 d.
1.2.2浅盘发酵.按照比例配制固态发酵培养基,并装于长20 cm、宽10 cm、高5 cm的浅盘中,用8层纱布和1层牛皮纸封口,121 ℃灭菌20 min.待物料冷却后,在超净工作台上去除纱布和牛皮纸,用灭菌的玻璃棒打散物料,接种液体菌种10%,并混合均匀,用灭菌的3层纱布封口,移至霉菌培养箱,于28 ℃、湿度70%条件下培养10 d.
1.2.3固态基质筛选.分别以稻壳、麸皮、木薯渣、秸秆粉为固态基料进行浅盘发酵试验,筛选出最佳基质后,以4∶1的比例分别与麦粒、玉米粉、木薯粉、豆饼粉、花生饼粉、啤酒糟混合发酵,并将筛选出的原料以0（CK）、5%、10%、15%、20%、25%的浓度梯度与基质混合,筛选固态基质最佳比例.每个处理3个平行.
1.2.4营养液筛选.在纯化水中分别加入1%的葡萄糖、蔗糖、糖蜜作为速效碳源,加入1%的硫酸铵、尿素、硝酸钠、蛋白胨、酵母粉作为速效氮源,并根据筛选结果分别以0（CK）、1%、2%、3%、4%、5%的浓度梯度进行浅盘发酵,7 d后取样计数,研究营养液中不同速效碳源和速效氮源对浅盘发酵的影响.分别在营养液中加入0.1%的磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、氯化钙作为无机盐,研究无机盐对浅盘发酵的影响,并根据试验结果,分别以0（CK）、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的浓度梯度研究无机盐的最佳含量.
1.3孢子计数
孢子计数采用血球计数板计数法,取固态发酵样品溶解、稀释,用血球计数板在显微镜下计数,并计算样品的孢子数.每个样品重复3次.
2结果与分析
2.1固态基质筛选
由图1可知,不同固态发酵基料对粉红粘帚霉G-019的浅盘发酵产孢量有显著影响,固态基料为麸皮时最佳,孢子数可达1.23×109 CFU/g,其后依次是木薯渣、秸秆粉和稻壳.
由图2可知,固态基质中加入的营养物质种类对粉红粘帚霉G-019浅盘发酵产孢量影响显著,加入玉米粉和啤酒糟时产孢量分别达到4.6×109 CFU/g和4.3×109 CFU/g.进一步单因素梯度试验表明,玉米粉含量为15%（图3）、啤酒糟含量为10%（图4）时,粉红粘帚霉G-019浅盘发酵的产孢量最高.因此,粉红粘帚霉G-019浅盘发酵的固态基质最佳配比为麸皮75%、玉米粉15%、啤酒糟10%,此配比下粉红粘帚霉G-019浅盘发酵产孢量可达到6.7×109 CFU/g.
2.2营养液筛选
由图5可知,在培养液中加入不同种类的速效碳源,对粉红粘帚霉G-019浅盘发酵产孢量均有明显的提升作用,其中以加入糖蜜效果最佳.根据单因素试验结果可知,营养液中加入2%糖蜜,浅盘发酵活菌数最高,可达8.5×109 CFU/g（图6）.
研究表明,营养液中加入各种速效氮源对粉红粘帚霉G-019浅盘发酵产孢量影响较小,这可能是因为固态基料中含有大量的啤酒糟（啤酒糟中含有大量的氮源,且在啤酒发酵过程中被分解为小分子量、可被快速吸收利用的氮源）,因而不需额外添加速效氮源.
由图8可知,营养液中加入磷酸氢二钾和硫酸镁对粉红粘帚霉G-019浅盘发酵产孢量有明显的提升作用.进一步研究表明,磷酸氢二钾的最佳含量为0.15%（图9）,硫酸镁的最佳含量为0.05%（图10）,此配比下粉红粘帚霉G-019浅盘发酵产孢量可达1.07×1010 CFU/g.
3结论与讨论
在粉红粘帚霉G-019浅盘发酵中,基质种类和比例以及营养液中的速效碳源、无机盐均对粉红粘帚霉G-019产孢量有显著影响.经研究表明,固态发酵基质为麸皮75%、玉米粉15%、啤酒糟10%,营养液为糖蜜2%、磷酸氢二钾0.15%、硫酸镁 0.05%,料液比1∶1时是粉红粘帚霉G-019浅盘发酵的最佳发酵培养基,浅盘发酵10 d最高孢子产量达到 1.07×1010 CFU/g.本研究可为后续的研究和工业化生产奠定基础.
4参考文献
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