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《小粒咖啡果皮总黄酮提取工艺优化与其体外抗氧化活性分析》

本文是总黄酮和咖啡方面毕业论文开题报告范文与抗氧化类毕业论文模板范文.

摘要：【目的】優化咖啡果皮总黄酮的超声波辅助提取工艺条件,并分析其体外抗氧化活性,为咖啡果皮的综合利用提供理论基础.【方法】以小粒咖啡果皮为原料、乙醇溶液为提取剂,在单因素试验的基础上,以乙醇体积分数、料液比、超声波时间和超声波温度4个因素为自变量,咖啡果皮总黄酮提取率为响应值,采用Box-Behnken试验设计方法,研究各自变量及其交互作用对咖啡果皮总黄酮提取率的影响,确定最佳提取工艺,并比较咖啡果皮总黄酮和L-抗坏血酸的抗氧化活性.【结果】4个因素对咖啡果皮总黄酮提取率的影响排序为超声波时间>料液比>乙醇体积分数>超声波温度,其中乙醇体积分数、料液比和超声波时间对总黄酮提取率有极显著影响（P<0.01）,超声波时间与超声波温度的交互作用对总黄酮提取率有显著影响（P<0.05）.咖啡果皮总黄酮提取工艺条件经优化后为：乙醇体积分数41%、料液比1∶46（g/mL）、超声波时间44 min、超声波温度60 ℃,在此条件下,得到的实际提取率（6.99±0.02）%与预测值（7.02%）的相对误差小.咖啡果皮总黄酮对1,1-二-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和羟自由基有一定的清除能力,其半清除浓度（IC50）分别为3.93和297.23 μg/mL,清除能力分别是L-抗坏血酸的61%和17%.咖啡果皮总黄酮具有一定还原力,还原力随质量浓度增加而增强.【结论】响应面法优化超声波辅助提取咖啡果皮总黄酮工艺切实可行,建立的回归模型拟合度和重现性较好,提取的总黄酮具有一定抗氧化能力.咖啡果皮可作为一种天然抗氧化剂来源在食品、医药等方面进行开发利用.

关键词：咖啡果皮;总黄酮;提取工艺;响应面;抗氧化活性

中图分类号： S571.2;TS201.1文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）02-0385-09

Optimization of extracting total flonoids from Coffea arabica peel and its antioxidant activity in vitro

WANG Yan-bing, WANG Xiao-yuan, XIAO Bing, YIN Hong-xing, LIU Xiao-qiong,ZHANG Hong-bo, DAI Yu-bo, LI Jin-hong*

（Dehong Tropical Agriculture Institute of Yunnan, Ruili, Yunnan 678600, China）

Abstract：【Objective】The optimization of process parameters for ultrasonic-assisted extraction of total flonoids from Coffea arabica（coffee） peel was investigated in this study. Meanwhile,the antioxidant activity in vitro was studied to provide a theoretical basis for the comprehensive utilization of coffee peel. 【Method】Using coffee peel as raw material, ethanol solution as the extraction agent,coffee peel total flonoids extraction yield as the response value,based on single-factor tests,Box-Benhnken center composite experiment was carried out with four factors, including ethanol volume fraction,solid-liquid ratio,ultrasonic time and ultrasonic temperature. Studying the effects of each variable and its interaction on the extraction rate of total flonoids from coffee peel, determining the optimum extraction technology and comparing the antioxidant activity of total flonoids in coffee peel with that of L-ascorbic acid. 【Result】The effects of four factors on the extraction rate of total flonoids from coffee peel was as follows： ultrasonic time>solid-liquid ratio>ethanol volume fraction>ultrasonic temperature. Ethanol volume fraction,solid-liquid ratio and ultrasonic time had extremely significant influence on total flonoids yield（P<0.01）. The interaction between ultrasonic time and ultrasonic temperature had significant influence on total flonoids yield （P<0.05）. The optimum technology conditions of total flonoids from coffee peel were obtained as follows： ethanol volume fraction 41%,solid-liquid ratio 1∶46 g/mL,ultrasonic time 44 min,ultrasonic temperature 60 ℃. Under the above optimum conditions,the total flonoids content of coffee peel reached up to （6.99±0.02）%,which was close to the theoretical value（7.02%）. Antioxidant evaluation showed that coffee peel flonoids had certain scenging abilities towards 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH） and hydroxyl free radical,and the cleanrance abilities were 61% and 17% of L-ascorbic acid,with the half cleanrance concentration（IC50） values being of 3.93 μg/mL and 297.23 μg/mL. The total flones of coffee peel had certain reducibility,and the reducing power increased with the increase of mass concentration. 【Conclusion】The response surface method can optimize the ultrasonic assisted extraction of total flonoids from coffee peel,and the established regression model has good fitting degree and reproducibi-lity. Extracted coffee peel total flonoids has antioxidant capacity. Coffee peel can be developed as a natural source of antioxidants in food industry and pharmacy, etc.

Key words： coffee peel; total flonoids; process optimization; response surface analysis; antioxidant activity

Foundation item： National International Scientific and Technological Cooperation Project（2014DFG32400）;Conservation of Species and Varieties（Tropical Crops） Project of Ministry of Agriculture and Rural Affairs（151813013540-52710）;Yunnan Major Science and Technology Special Project（2018ZG014）;Yunnan Science and Technology Project（2016DC026）

0 引言

【研究意义】咖啡属茜草科（Rubiaceae）咖啡属（Coffea）小乔木或大灌木,与可可、茶叶并称为世界三大饮料,是仅次于石油的第二大贸易商品（Behrouzian et al.,2016）.我国是咖啡种植国之一,产区主要集中在云南和海南,产量占全球总量的1.5%,其中云南小粒咖啡种植面积及生豆产量均占全国咖啡产业的98%以上,在我国咖啡产业中占有举足轻重的地位（代正明等,2018;匡钰等,2018）.咖啡果皮是咖啡加工过程的初级副产物,约占咖啡干重的29.0%（Janissen and Huynh,2017）.云南小粒咖啡多采用半湿法和湿法进行脱皮,每干制生产1 t咖啡豆,产生的咖啡果皮达2 t以上（Prata and Oliveira,2007;匡钰等,2018）.国内对咖啡果皮的利用尚停留在初级阶段,除部分用于堆肥外,大部分被当作废弃物丢弃,造成极大的资源浪费和环境污染（丹等,2019）.咖啡果皮富含纤维素、蛋白质、总糖、氨基酸、脂肪酸及花青素（张云鹤等,2016）和芦丁（Heeger et al.,2017）等黄酮类物质,营养成分丰富,具有较高的开发利用价值（胡荣锁等,2018）.植物源黄酮类物质具有抗痉挛、抑菌、消炎、清除自由基和抑制致癌化合物诱变等功效,是国内外食品、药品及保健品等相关领域的研究热点（Li et al.,2009;方芳和王凤忠,2018;Perez-Vizcaino and Fraga,2018;王彦兵等,2019;张焕新等,2019）.因此,研究咖啡果皮总黄酮提取工艺及其抗氧化活性,对提高咖啡资源综合利用率及其附加值具有重要意义.【前人研究进展】在咖啡加工副产物的黄酮提取方面,刘鑫和高彦祥（2011）研究了静态亚临界水提取脱脂咖啡渣中黄酮类物质的工艺,在最佳提取条件（提取温度170 ℃、时间45 min、料液比1∶50）下,黄酮提取率为6.97%.在咖啡果皮综合利用方面,国内主要集中在花青素提取（张云鹤等,2016）、果皮茶制作（罗娅婷等,2018）和膳食纤维提取（丹等,2019）等方面,而国外对其研究范围较广,包括酶（Pandey et al.,2000;Dias et al.,2015;Bhoite and Murthy,2015）和有機酸（Pleissner et al.,2016）提取、生物基质（Pandey et al.,2000）和青贮饲料（Salinas-Rios et al.,2015）制备、绿色能源（Corro et al.,2013;Menezes et al.,2014）开发等.浆果类普遍富含黄酮类物质,皮渣作为其加工工程中的副产物,可为天然黄酮的开发提供大量原材料.焦岩等（2013）应用正交试验优化超声波辅助提取猕猴桃果皮总黄酮工艺,最佳条件（液固比30∶1、提取时间40 min、乙醇体积分数60%、提取温度60 ℃）下的黄酮提取率为2.68%;罗群等（2013）利用正交试验优化超声波辅助提取石榴皮黄酮工艺,在最佳工艺条件（提取温度75 ℃、提取时间20 min、超声功率400 W、料液比1∶20、超声间歇时间5 s/3 s、提取次数1次）下黄酮提取率为5.97%;黄正虹（2014）利用正交试验优化超声波辅助提取葡萄皮黄酮工艺,在最佳工艺条件（超声处理功率250 W、液固比50∶1、超声处理温度50 ℃、超声处理时间60 min）下得到黄酮提取率为6.20%;冯智鹏等（2017）利用正交试验优化乙醇浸提法提取沙棘果渣黄酮工艺,在最佳条件下得到黄酮提取率为1.72%.【本研究切入点】目前,对于咖啡果皮黄酮提取及其功能的研究鲜见报道,极大限制了咖啡果皮资源的综合开发利用.【拟解决的关键问题】以小粒咖啡果皮为试验材料,优化咖啡果皮总黄酮超声波辅助提取工艺,并对其体外自由基清除能力和还原力进行研究,旨在为咖啡果皮资源的综合利用提供参考依据.

1 材料与方法

1. 1 试验材料

新鲜小粒咖啡果实（品种为卡蒂姆CIFC7963）采摘于农业农村部瑞丽咖啡种质资源圃,洗净后采用半湿法脱皮脱胶,收集果皮,蒸馏水多次清洗,去除果胶,50 ℃真空干燥,粉碎过60目筛,常温保存备用.1,1-二-2-三硝基苯肼（DPPH,生物试剂）购自山东西亚化学工业有限公司;芦丁标准品（HPLC≥98%）购自北京世纪奥科生物技术有限公司;亚硝酸钠、硝酸铝、硫酸亚铁、氢氧化钠、铁、三氯化铁、抗坏血酸和无水乙醇均为分析纯,购自天津市风船化学试剂科技有限公司;磷酸二氢钠和磷酸氢二钠（优级纯）购自天津市光复精细化工研究所;三氯乙酸（分析纯）购自成都市科隆化学品有限公司;水杨酸（分析纯）购自上海化学试剂有限公司试剂一厂.主要仪器设备：VOS-90A真空干燥箱[施都凯仪器设备（上海）有限公司]、ME201电子天平[梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司]、SB25-12DTS超声波双频清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、T6紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、CT14D台式高速离心机（上海天美生化仪器设备工程有限公司）和Labonova Smar超纯水机（德国Think-lab公司）.

1. 2 试验方法

1. 2. 1 果皮总黄酮提取流程称取1.0 g咖啡果皮样品粉末→特定条件下超声波提取→离心→吸取上清液→待测.

1. 2. 2 总黄酮含量测定

1. 2. 2. 1 标准曲线绘制参照王彦兵等（2019）的方法.绘制芦丁质量浓度（x）与吸光值（y）间的线性关系,得到回归方程：y等于11.6740x-0.0019（R2等于0.9996）.

1. 2. 2. 2 总黄酮提取率计算将待测液稀释,取适量于10 mL比色管中,按1.2.2.1的方法计算稀释液总黄酮质量浓度,根据公式（1）计算提取率.

总黄酮提取率（%）等于[C×n×Vm×10] （1）

式中,C为提取液中总黄酮质量浓度（mg/mL）,n为稀释倍数,V为提取液总体积（mL）,m为咖啡果皮质量（g）,10为转换系数.

1. 2. 3 单因素试验

1. 2. 3. 1 乙醇体积分数选择固定料液比1∶30（g/mL,下同）、超声波时间50 min、超声波温度50 ℃,考察乙醇体积分数为30%、40%、50%、60%、70%和80%条件下的咖啡果皮总黄酮提取率.

1. 2. 3. 2 料液比选择固定乙醇体积分数40%、超声波时间50 min、超声波温度50 ℃,考察料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60条件下的咖啡果皮总黄酮提取率.

1. 2. 3. 3 超声波时间选择固定乙醇体积分数40%、料液比1∶40、超声波温度50 ℃,考察超声波时间为30、40、50、60、70和80 min条件下的咖啡果皮总黄酮提取率.

1. 2. 3. 4 超声波温度选择固定乙醇体积分数40%、料液比1∶40、超声波时间40 min,考察超声波温度为30、40、50、60、70和80 ℃条件下的咖啡果皮总黄酮提取率.

1. 2. 4 响应面优化在单因素试验的基础上,依据Box-behnken中心组合原理,以咖啡果皮总黄酮提取率为考察指标,设计响应面试验优化超声波提取工艺.响应面试验因素与水平设计见表1.

1. 2. 5 抗氧化活性研究

1. 2. 5. 1 DPPH自由基清除率测定参照王彦兵等（2019）的方法,选用L-抗坏血酸作阳性对照.根据公式（2）计算DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率（%）等于[1-Ai-AjAc]×100 （2）

式中,Ai为样品溶液吸光值,Aj为无水乙醇代替DPPH溶液的对照组吸光值,Ac为纯水代替样品溶液的空白组吸光值.

1. 2. 5. 2 羟自由基清除率测定参照王彦兵等（2019）的方法,选用L-抗坏血酸作阳性对照.根据公式（3）计算羟自由基清除率：

羟自由基清除率（%）等于[1-A-A1A0]×100 （3）

式中,A为样品溶液吸光值,A1为纯水代替过氧化氢溶液的对照组吸光值,A0为纯水代替样品溶液的空白组吸光值.

1. 2. 5. 3 總还原能力测定参照符群等（2019）的方法并加以改进：用蒸馏水将样品溶液分别稀释至10.0、20.0、40.0、60.0、80.0和100.0 μg/mL,分别吸取样品稀释溶液1.0 mL,均加入0.2 mol/L磷酸钠缓冲液2.0 mL和1.0%铁溶液2.0 mL,混匀,50 ℃水浴20 min,迅速冷却后加入10.0%三氯乙酸溶液2.0 mL,混匀.将混合溶液稀释2倍后吸取4.0 mL置于10 mL比色管中,加入0.1%三氯化铁溶液0.4 mL,混匀,以蒸馏水为参比,测定溶液在700 nm波长处吸光值（A）.以同浓度L-抗坏血酸作阳性对照.

1. 3 统计分析

试验进行3次重复测定.采用Design-Expert 8.0.6、DPS 2000和Origin 8.5进行响应面优化和数据统计分析.

2 结果与分析

2. 1 单因素试验结果

2. 1. 1 乙醇体积分数对咖啡果皮总黄酮提取率的影响如图1所示,在30%～40%范围内,咖啡果皮总黄酮提取率随乙醇体积分数的增大而升高,在40%时达最大值（6.07%）,显著高于其他乙醇体积分数下的总黄酮提取率（P<0.05,下同）;在40%～80%范围内,增大乙醇体积分数,总黄酮提取率降低.随着乙醇体积分数不断增大,溶液极性逐渐减小,当乙醇溶液与提取物极性相近时,总黄酮提取率达最大值.因此,后续响应面试验将乙醇体积分数设定为30%～50%.

2. 1. 2 料液比对咖啡果皮总黄酮提取率的影响

如图2所示,料液比为1∶10～1∶40时,咖啡果皮总黄酮提取率随提取溶剂体积的增大而升高,料液比为1∶40时达最大值（6.73%）,料液比为1∶40～1∶60时,总黄酮提取率有所降低.一定范围内,增大溶剂体积有利于黄酮溶出;但溶剂体积不断增大,会导致杂质大量溶出,黄酮有效溶出减少.料液比1∶40与1∶50间的总黄酮提取率无显著差异（P>0.05,下同）,但与料液比1∶30差异显著,因此,后续响应面试验料液比设定为1∶30～1∶50.

2. 1. 3 超声波时间对咖啡果皮总黄酮提取率的影响如图3所示,咖啡果皮总黄酮提取率随超声波时间的延长呈先升后降的变化趋势,当超声波时间为40 min时,总黄酮提取率最高（6.69%）.一定范围内,延长超声波时间有利于黄酮溶出;但长时间超声受热易破坏黄酮类物质的稳定结构,加之杂质溶出增多,使有效黄酮类物质溶出减少.超声波时间40 min与30 min的总黄酮提取率间差异显著,与超声波时间50 min的提取率差异不显著,但提取率呈减少趋势,因此,后续响应面试验将超声波时间设定为30～50 min.

2. 1. 4 超声波温度对咖啡果皮总黄酮提取率的影响超声波温度为30～60 ℃时,咖啡果皮总黄酮提取率随超声波温度的升高而显著增加,在60 ℃时达最大值（6.93%）,超声波温度为60～80 ℃时,总黄酮提取率逐渐降低（图4）.升高温度可加快黄酮溶出,但温度过高,杂质溶出亦增多,加之黄酮类物质不耐高温,使其有效溶出减少.60 ℃的提取率与其他超声波温度的提取率间差异显著,因此,后续响应面试验将超声波温度设定为50～70 ℃.

2. 2 响应面试验结果

2. 2. 1 回归模型及方差分析结果应用Design- Expert 8.0.6,设计以乙醇体积分数（A）、料液比（B）、超声波时间（C）和超声波温度（D）为自变量的4因素3水平共29个试验点的响应面分析试验（表2）.试验结果经多元回归拟合,得到咖啡果皮总黄酮提取率（Y）与4个自变量之间的四元二次回归模型：Y等于6.94+0.061A+0.071B+0.32C+0.017D+0.030AB-0.010AC+0.027AD+0.025BC+0.018BD+0.063CD-0.51A2-0.067B2-0.44C2-0.58D2.

由表3可知,經方差分析,模型（P<0.0001）极显著,失拟度（P等于0.5466>0.05）不显著,说明该模型切实可行;R2adj等于0.9818,表明提取率变异中仅1.82%不能由该模型解释;相关系数R2等于0.9909,说明试验值与预测值拟合较好;变异系数（CV等于0.93%）<5%,表明试验可靠性高,重复性好.由F、P及显著性水平差异可知,4因素对咖啡果皮总黄酮提取率的影响排序为：C>B>A>D.一次项A、B和C及二次项A2、C2和D2对响应值的影响达极显著水平（P<0.01,下同）;交互项CD和二次项B2对响应值的影响达显著水平.

2. 2. 2 响应面分析结果 4个因素交互作用对咖啡果皮总黄酮提取率影响的响应面如图5所示.各因素的变化均为开口向下的抛物线,响应曲面呈山峰状,即各因素变化趋势是先增加后减少,存在极大值,与单因素试验结果相符.从图5可看出,超声波时间与超声波温度交互作用的响应曲面表现最陡峭,其交互作用显著,与方差分析结果相符.

2. 2. 3 提取工艺确定及验证优化后的提取条件为：乙醇体积分数40.75%、料液比1∶46.17、超声波时间43.79 min、超声波温度60.47 ℃,咖啡果皮总黄酮的理论提取率为7.02%.为便于操作,修正工艺参数为：乙醇体积分数41%、料液比1∶46、超声波时间44 min、超声波温度60 ℃.在此条件下,经3次重复试验得到的咖啡果皮总黄酮实际提取率为（6.99±0.02）%,与理论值相对误差为0.43%,表明建立的回归模型准确可靠、重复性好,优化设计方案切实可行.

2. 3 抗氧化活性分析结果

2. 3. 1 DPPH自由基清除能力咖啡果皮总黄酮和L-抗坏血酸对DPPH自由基的清除率如图6所示.由图6可知,DPPH自由基清除率随咖啡果皮总黄酮和L-抗坏血酸质量浓度的增加呈上升趋势,质量浓度为20.0 μg/mL时,二者的清除率分别为92.16%和98.81%.咖啡果皮总黄酮对DPPH自由基清除率的抑制方程为y等于3.8755+1.893x（R2等于0.9914）,半清除浓度（IC50）等于3.93 μg/mL;L-抗坏血酸对DPPH自由基清除率的抑制方程为y等于4.0927+2.398x（R2等于0.9904）,IC50等于2.39 μg/mL.由IC50可看出咖啡果皮总黄酮对DPPH自由基清除能力是L-抗坏血酸的61%.

2. 3. 2 羟自由基清除能力如图7所示,在一定质量浓度范围内,咖啡果皮总黄酮和L-抗坏血酸对羟自由基清除能力的量效关系显著,质量浓度为400.0 μg/mL时,二者的清除率分别为60.47%和96.30%.咖啡果皮总黄酮对羟自由基清除率的抑制方程为y等于0.1721+1.9738x（R2等于0.9889）,IC50等于297.23 μg/mL;L-抗坏血酸对羟自由基清除率的抑制方程为y等于1.8751+1.8668x（R2等于0.9966）,IC50等于47.20 μg/mL.由IC50可看出咖啡果皮总黄酮对羟自由基清除能力是L-抗坏血酸的17%.

2. 3. 3 总还原能力还原力以吸光值衡量,吸光值越大,还原力越强.由图8可知,在10.0～100.0 μg/mL范围内,随咖啡果皮总黄酮和L-抗坏血酸质量浓度的升高,吸光值不断增大,即还原力增强,当质量浓度为100.0 μg/mL时,果皮总黄酮和L-抗坏血酸的还原力吸光值分别为0.871和0.869,表明咖啡果皮总黄酮具有一定还原力.

3 讨论

超声波辅助是提取植物总黄酮的常用方法,具有操作方便、省时、提取率高等优点;乙醇溶剂作为提取剂,安全无毒且可回收利用（方芳和王凤忠,2018;何军,2019）.影响超声波辅助乙醇提取植物总黄酮的因素较多,包括乙醇体积分数、料液比、超声波时间、超声波温度等,影响因素的改变可导致总黄酮有效溶出及稳定性的改变.本研究利用4因素3水平响应面试验优化咖啡果皮总黄酮超声波辅助提取工艺,建立了咖啡果皮总黄酮提取率的回归模型,模型稳定可靠、切实可行,各工艺条件对总黄酮提取率的影响排序为超声波时间>料液比>乙醇体积分数>超声波温度.其中,超声波时间、料液比和乙醇体积分数对咖啡果皮总黄酮提取率有极显著影响,超声波时间与超声波温度的交互作用对总黄酮提取率影响显著.最佳条件经回归模型优化为：乙醇体积分数41%、料液比1∶46、超声波时间44 min、超声波温度60 ℃,在此条件下的总黄酮提取率为（6.99±0.02）%,高于猕猴桃皮（2.68%）（焦岩等,2013）、石榴皮（5.97%）（罗群等,2013）、葡萄皮（6.20%）（黄正虹,2014）和沙棘皮渣（1.72%）（冯智鹏等,2017）等浆果类果皮的黄酮提取率.可见,咖啡果皮作为初级加工副产物,具有重要的开发研究价值.

自由基与肿瘤及心血管疾病密切相关,天然抗氧化剂具有清除自由基功效,因此从植物中提取抗氧化剂已逐渐成为医药、食品及材料等领域的研究热点（Li et al.,2011）.目前,由于体内活性研究投入大、耗时长,抗氧化活性物质筛选集中于体外模拟测定（熊双丽等,2012）.本研究结果表明,咖啡果皮总黄酮对DPPH自由基和羟自由基具有清除作用,一定范围内,清除能力随质量浓度增加而增强,但其清除效果低于L-抗坏血酸,可能是因为试验所用的咖啡果皮总黄酮纯度不高,一定量的杂质会影响黄酮类物质的共轭结构.咖啡果皮总黄酮对DPPH自由基和羟自由基清除能力的IC50分别为3.93和297.23 μg/mL,分别是L-抗坏血酸清除能力的61%和17%,表明咖啡果皮总黄酮具有一定的抗氧化性,但对不同自由基清除能力存在差异,是由黄酮类化合物结构所决定,其羟基数量和位置直接影响抗氧化活性（张黎明等,2014）.此外,咖啡果皮总黄酮具有一定的还原力,为其发挥抗氧化作用提供了可能.因此,下一步将开展分离和纯化咖啡果皮总黄酮及确定有效抗氧化成分結构研究.

4 结论

响应面法优化超声波辅助提取咖啡果皮总黄酮工艺条件切实可行,提取率高,回归模型可用于实际生产预测;提取的咖啡果皮总黄酮具有一定抗氧化能力,咖啡果皮可作为一种天然抗氧化剂来源在食品、医药等方面进行开发利用.

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总黄酮和咖啡引用文献: