《基于16S rRNA基因序列鉴定秘鲁茎柔鱼和澳洲双柔鱼》
该文是关于澳大利亚和科学方面论文范文资料跟序列方面本科论文开题报告范文.
摘 要：通过对秘鲁茎柔鱼及澳洲双柔鱼的线粒体16S rRNA基因片段进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增和序列比对,确定2 种柔鱼品种的特异性位点,并由此设计品种特异性引物.利用多重PCR体系对秘鲁茎柔鱼和澳洲双柔鱼进行快速、准确地鉴定和区分,并对该体系的灵敏度进行检验.结果表明：在多重PCR体系下,秘鲁茎柔鱼和澳洲双柔鱼分别扩增出长度400、229 bp的品种特异性条带,2 种柔鱼的混合样品则同时扩增出长度400、229 bp的条带;且该多重PCR体系可以检测澳洲双柔鱼中1%秘鲁茎柔鱼的掺入,检测限为0.1 ng.
关键词：秘鲁茎柔鱼;澳洲双柔鱼;16S rRNA;多重聚合酶链式反应
Abstract： The aim of this study is to establish a rapid and accurate method for molecular discrimination of two squid species, Nototodarus gouldi and Dosidicus gigas. The fragments of mitochondrial 16S rRNA were amplified by polymerase chain reaction （PCR） from the genomic DNA of each squid species. Polymorphic sites were determined by multiple sequence alignments and species-specific primers were designed. Multiplex PCR was conducted for molecular identification of the two squid species with the species-specific primer pairs. Multiplex PCR results showed that specific amplicons of 400 and 229 bp were generated from D. gigas and N. gouldi, respectively. Both 400 and 229 bp amplicons were obtained from the mixtures of the two species. The sensitivity test results showed that the method could detect D. gigas adulteration at 1% in N. gouldi with a limit of detection of 0.1 ng.
Keywords： Dosidicus gigas; Nototodarus gouldi; 16S rRNA; multiplex polymerase chain reaction
头足类（Cephalopoda）为软体动物门（Mollusca）的重要类群,现存总类800余种[1],是海洋中最大的食物资源之一.头足类水产品一直以来都属于全世界重点开发的海洋渔业资源,近几十年来,世界头足类捕捞量在海洋捕捞渔业中的份额呈现持续增长趋势[2].头足类海产品数量庞大,种类丰富,目前已经进行商业性开发的主要有柔鱼类（Ommastrephidae）、乌贼类（Loliginidae）、乌贼类（Sepiidae）和章鱼类（Octopodidae）等,其中,柔鱼类的开发比重最大[3].柔鱼类生长周期短,味道鲜美,富含蛋白质和多种人体必需氨基酸,营养价值很高[4],可食用部分可达80%以上,素有“穷人的鲍鱼”之称.茎柔鱼（Dosidicus gigas）亦称“秘鲁茎柔鱼”,柔鱼科（Ommastrephidae）、茎柔鱼属（Dosidicus）[5].
广泛分布于中部太平洋以东海域,尤其在秘鲁沿岸及外海资源丰富[6-7].秘鲁茎柔鱼生长速度快、体型较大、世界范围内产量较高,是全球最重要的经济头足類资源之一[8].据联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization,FAO）统计,2003—2012年世界秘鲁茎柔鱼的年平均产量达到77.84 万t[9].澳洲双柔鱼（Nototodarus gouldi）亦称“澳大利亚鱿”,只分布于澳大利亚东南部和西部海域以及新西兰海域[10],目前开发力度不大,年最高产量不足万吨,因此价值较高.
秘鲁茎柔鱼营养丰富,但是由于体内非蛋白氮（nonprotein nitrogen,NPN）和某些游离氨基酸的存在,会散发出氨的气味,且肉质偏苦[11].因此,秘鲁茎柔鱼的市场价值远远低于相对稀少的澳洲双柔鱼.往往会有不法商贩为了追求更高的经济利益,而将秘鲁茎柔鱼假冒或掺入澳洲双柔鱼中进行市场销售.传统的柔鱼鉴定方式主要是通过形态学特征,如大小的差异、形状的不同及色泽的多变来加以区分和鉴定[12-13],但在不同环境生长、处于不同发育阶段、经历不同加工方式的同种柔鱼之间,外观形态也会产生很大差异.并且为了保证远洋柔鱼的鲜度,一般制成冻品或半成品保存[14],或是通过加工成柔鱼丁、柔鱼圈、柔鱼丝和烤柔鱼片等柔鱼制品进行市场流通[15].形态学鉴定适合整条鱼的物种鉴定,一旦进行了切片、绞碎等工艺,形态学特征彻底缺失以后,柔鱼的鉴定将变得异常困难[16].因此,寻求一种高效、快速鉴别澳洲双柔鱼和秘鲁茎柔鱼的方法显得尤为重要.
DNA分子标记技术由于具有特异性好、灵敏度高、操作简单且重复性好等优势,已被越来越多地运用到物种鉴定中,它能够反映不同物种个体或种群之间基于基因组的某些差异特征,是DNA分子水平上遗传多样性的直接反映[17-18].在鱼类基因组序列中,核基因和线粒体基因为常用的两大类分子标记,但由于核基因中存在大量内含子等非编码序列,因此很难找到合适的分子来进行标记.线粒体基因组作为独立存在于高等动物细胞核外唯一的遗传物质,基因排列结构紧密,进化速度快,严格母系遗传且在细胞质中大量存在,相对简单且适合运用于DNA分子标记生物学研究.本研究通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术扩增秘鲁茎柔鱼和澳洲双柔鱼的线粒体16S rRNA基因片段,并进行测序和分析,根据2 种柔鱼品种测序结果序列之间单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphi,SNP）位点的差异,设计品种特异性引物,从而通过多重PCR体系对2 种柔鱼单独样品和混合样品进行区分和鉴定.
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
秘鲁茎柔鱼和澳洲双柔鱼由某公司提供,产地分别为秘鲁和澳大利亚.
海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒（DP324-02）天根生化科技（北京）有限公司;2×Premix DNA polymerase、Agarose、100 bp PlusII DNA Ladder（BM321）、双蒸水 北京全式金生物技术有限公司;无水乙醇（分析纯） 天津市富宇精细化工有限公司.
1.2 仪器与设备
TG18W台式高速微量离心机 长沙湘智离心机仪器公司;T100TM PCR仪 美国Bio-Rad公司;DYY-10C电泳仪 北京六一仪器厂;Microchemi 4.2凝胶成像
系统 以色列DNR公司.
1.3 方法
1.3.1 基因组DNA的提取
以所选秘鲁茎柔鱼和澳洲双柔鱼的冷冻样品作为原料,剪取肌肉组织保存于95%乙醇中.取保存样品肌肉组织30 mg左右,剪碎后置于已灭菌的研钵内,混合液氮研磨至粉末状,采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒进行提取,所得基因组DNA于-20 ℃条件下保存备用.
1.3.2 PCR扩增与测序
对于所提取2 种柔鱼基因组DN段,针对海洋动物线粒体16S rRNA基因序列,使用16S rRNA通用引物进行PCR扩增[19].用于扩增线粒体16S rRNA基因的通用引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成,序列分别为16：5’-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3’和16SR：5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’.
PCR反应总体系为20 μL：模板DNA 10 ng、2×Premix DNA polymerase 10 μL、正向及反向引物各2 μL（0.5 μmol/L）,加灭菌双蒸水至20 μL.PCR反应条件：94 ℃预变性4 min,94 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共33 个循环,72 ℃延伸5 min.
PCR扩增结束后,通过混有荧光染料溴化乙锭（ethidium bromide,EB）的1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测,并将在凝胶成像系统观测下条带清晰、明亮且单一的产物送至英潍捷基（上海）贸易有限公司北京实验室进行正反双向测序.
1.3.3 特异性引物设计
测序完成获得原始序列数据后,将正向、反向引物数据导入SeqMan软件,去除两端不可信部分后进行人工拼接,秘鲁茎柔鱼和澳洲双柔鱼得到长度分别约为552、553 bp的16S rRNA基因序列（Genbank登录号分别为GU324169和GQ365324）.通过GenBank数据库下载得相应柔鱼的线粒体16S rRNA基因序列,并在数据库中进行Nucleotide Blast比对,根据序列相似度对样品的物种进行鉴别,再次确保所选样品物种与标签一致.通过Clustal X软件对测序结果进行多序列对比和分析,并用Primer Premier 5软件设计秘鲁茎柔鱼和澳洲双柔鱼的品种特异性引物.
1.3.4 多重PCR鉴定
以秘鲁茎柔鱼和澳洲双柔鱼的双位点特异性引物为正向引物,利用Primer Premier 5软件筛选二者的反向引物.筛选反向引物时注意3 条引物的退火温度保持接近,并避免模板错配及引物间二聚体的产生,确定利用16SR作为反向引物.利用3 条引物对2 种柔鱼的模板DNA及混合样品进行多重PCR扩增.多重PCR反应总体系为20 μL：模板DNA 10 ng、2×Premix DNA polymerase 10 μL、正向引物DGF 1 μL（0.5 μmol/L）、正向引物NGF 1 μL（0.5 μmol/L）、反向引物16SR 2 μL（0.5 μmol/L）,加灭菌双蒸水至20 μL.PCR反应条件：94 ℃预变性4 min,94 ℃变性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共33 个循环,72 ℃延伸5 min.多重PCR扩增结束后,通过混有荧光染料EB的1%琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像系统中对多重PCR产物进行检测.
1.3.5 灵敏度测定及市售样品检测
为测定该多重PCR体系的灵敏度,将DNA模板总量设置为10 ng,以2 种柔鱼的混合样品为模板,其中秘鲁茎柔鱼DNA的质量分数依次为0%、1%、2%、10%及50%.同时分别对市售的2 种秘鲁茎柔鱼和2 种澳洲双柔鱼样品进行检测,以验证本方法在实际中应用的可行性.多重PCR反应条件如1.3.4节所述.扩增结束后,在凝胶成像系统中对多重PCR产物进行检测.
2 结果与分析
2.1 16S rRNA序列比对
通过线粒体16S rRNA通用引物扩增出的秘鲁茎柔鱼和澳洲双柔鱼基因序列长度分别约为552、553 bp,并上传至GenBank数据库.由图1可知：对2 种柔鱼品种的扩增基因序列进行比对后,第173和174号位秘鲁茎柔鱼显示为T、C碱基,而澳洲双柔鱼则为C、T碱基,根据这2 个错配碱基设计秘鲁茎柔鱼的正向特异性引物DGF;第345、346、347号位秘鲁茎柔鱼显示为A、A、T碱基,而澳洲双柔鱼则为G、G、C碱基,根据这3 个错配碱基设计澳洲双柔鱼的正向特异性引物NGF.
2.2 特异性引物设计结果
根据秘鲁茎柔鱼的SNP位点,设计其正向特异性引物DGF（5’-GAAGGTTAATCTGTCTCCATC-3’）,利用通用引物16SR作为反向引物;根据澳洲双柔鱼的SNP位点,设计其正向特异性引物NGF（5’-TATGATTAATAACTTCCTTAGGC-3’）,同样利用通用引物16SR作为反向引物.2 種柔鱼的品种特异性引物在16S rRNA基因序列中的相对位置如图1所示.
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澳大利亚和科学引用文献:
[1] 澳大利亚和科学硕士论文开题报告范文 澳大利亚和科学相关本科论文开题报告范文2万字
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