《健康和感染枯萎病辣椒植株根际土壤真菌群落结构和多样性》
本文是关于群落结构和真菌毕业论文模板范文与土壤方面本科论文怎么写.
摘 要近年来,辣椒枯萎病发生越来越严重.为了比较感染枯萎病和健康辣椒根际土壤真菌群落多样性和结构的差异,本研究采用Illumina Miseq测序技术,对漳州3个辣椒种植基地枯萎病典型患病样地的健康植株和感病植株根际土壤中的真菌18S rRNA基因V4区片段进行高通量测序.结果表明,感染枯萎病辣椒植株根际土壤真菌群落多样性低于健康植株.子囊菌门（Ascomycota）为健康与感染枯萎病植株根际土壤的最优势门,丰度分别为18.5%和38.23%.健康和感染枯萎病植株的优势属为被孢霉菌属（Mortierella）、假裸囊菌属（Pseudogymnoascus）、镰刀菌属（Fusarium）和红曲霉菌属（Monascus）,感染枯萎病植株的被孢霉菌属相对丰度显著低于健康植株,而镰刀菌属和红曲霉菌属相对丰度显著高于健康植株.
关键词辣椒;枯萎病;根际土壤;高通量测序技术;真菌多样性
中图分类号S763.15文献标识码A
文章编号 1007-5739（2020）07-0184-04开放科学（资源服务）标识码（OSID）
Fungus Community Structure and Diversity of Rhizosphere Soil of Healthy and Fusarium Wilt Chilli Plants
WU Zhen- 1DAI Rui-qing 1LAI Bao-chun 1 *LIN Ming-hui 2WANG Jia-rui 1
（1 Zhangzhou Institute of Agricultural Sciences of Fujian Province,Zhangzhou Fujian 363005; 2 Anhou Forestry Station of Pinghe Forestry Bureau）
AbstractIn recent years,fusarium wilt chilli has become more and more serious.In order to understand the differences of the funguns community structure and diversity of healthy and fusarium wilt chilli plants in rhizosphere soil.The V4 region of the fungus 18S rRNA gene in soil was amplified,and the amplified fragments were sequenced using Illumina MisSeq high-throughput sequencing technology in this paper.The result showed that the funguns community diversity of wilt chilli plants in rhizosphere soil was lower than the healthy.Ascomycota were the dominant phylum in healthy and wilt chilli plants,which relative abundance were 18.5% and 38.23% respectively.The dominant genera in healthy and wilt chilli plants in rhizosphere soil were Mortierella,Pseudogymnoascus,Fusarium and Monascus.The relative abundance of Mortierella in wilt chilli plants was lower than healthy plants,but the relative abundance of Fusarium and Monascus was higher than healthy plants.
Key wordschilli;fusarium wilt;rhizosphere soil;high-throughput sequencing technology;fungus diversity
辣椒枯萎病是由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）入侵辣椒根系,进而引起辣椒的茎和根基部维管束枯萎腐烂,是一种非常典型的真菌性病害[1].该病原菌的植物寄主分布广泛,可引起茄类、黄瓜、香蕉、棉花等100多种植物枯萎病的发生.作物被病原菌侵染后,叶片和茎秆变黃,根系腐烂,植株枯萎,长势衰弱,严重时枯死[2-3].随着我国辣椒种植年限的增加,种植面积逐年扩大,复种指数不断提高,土壤中病原菌不断积累,辣椒枯萎病在全国各地普遍发生,造成严重的损失,给辣椒产业发展带来极大的威胁[4].虽然辣椒枯萎病已经引起众多研究者的注意,但是由于该病较复杂,目前尚无有效的防治措施和方法.
根际土壤微生物是土壤生态系统的重要组分,在促进植物生长和维持土壤生态平衡等过程中起着十分重要的作用,植物与根际微生物相互作用对植物健康及土壤肥力产生不同的影响[5-6].土壤真菌是土壤微生物的主要成员,土壤有机质等养分的转换均受到土壤真菌物种组成和数量变化的影响[7-8].研究表明,土壤真菌多样性与土传病害的发生及植物健康存在密切关系[9-10].陈洁作等[11]研究表明,野果林健康株覆盖区表层土壤真菌群落的多样性高于患病株覆盖区土壤.李雪萍[12]研究发现,青稞根腐类病害的发生使青稞根际土壤真菌的群落结构发生变化,且发病越严重,与健康青稞植株根际土壤微生物群落结构的差异也越大.结构丰富且多样性高的土壤微生物群体对土传病害有抑制作用,土传病害发生较轻;反之,发生较重.因此,为了研究和防治土壤传播疾病,应积极从土壤微生物结构和多样性研究等入手[13].目前,有关辣椒感染枯萎病后,其根际土壤真菌群落结构和多样性的变化鲜有报道.高通量测序技术以其高读长、精度高、通量高和无偏性的自身优势被广泛应用于微生物的群落多样性,为研究根际微生物的群落结构和多样性提供了一个新的方向[14-15].为此,本研究采用Illumina MiSeq高通量测序技术,对辣椒感染枯萎病植株与健康植株的根际土壤真菌群落结构与多样性进行系统分析,比较辣椒种植基地健康和感染枯萎病辣椒根际土壤真菌群落结构组成及多样性,为辣椒枯萎病的防控提供参考依据.
1材料与方法
1.1供试土样
本试验所采集的土样取自福建省3个辣椒种植基地,分别为南靖、平和、漳州市农业科学研究所,采样地辣椒枯萎病均发病较重且病症典型.于同一辣椒种植田块中同时采集健康和感病的辣椒根际土壤（不易被抖下的土壤视为根际土壤）.去除地上部分后,依次挖主根、須根,采用抖落法采集根际土[16],每个土样取5株.土样过20目筛,装入采样袋于-20 ℃条件冷藏待用.
1.2DNA提取
将根际土壤样品精确称取200 mg并加入2 mL离心管中,取70%乙醇1 mL加入,然后以10 000 r/min离心3 min,弃上层液.加入1×PBS溶液,振荡混匀,室温条件下以10 000 r/min离心3 min,弃上层液体.将离心管倒扣在吸水纸上至管内无液体流下,在55 ℃烘箱中处理10 min.对制备好的样品提取土壤样品基因组DNA,使用OMEGA试剂盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit.对基因组DNA精确定量,检测试剂盒选择用Qubit_2.0 DNA,从而确定适宜DNA量以进行PCR反应.
1.3基因扩增及测序
以样品DNA为模板,使用Miseq测序平台的V4区通用引物（18SV4F：GGCAAGTCTCGGTGCCAG;18SV4F：ACGGTA TCTRATCRTCTTCG）进行PCR扩增.扩增体系：模板DNA 量为10～20 ng,加水溶解定容至30 μL;加primer F（10 μmol/L）2 μL;加15 μL 2×Taq master Mix.PCR反应程序：于94 ℃预变性 3 min;94 ℃变性30 s,于45 ℃退火 20 s,于65 ℃延伸 30 s,5个循环;于94 ℃变性20 s,再于55 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,20个循环,最后于72 ℃延伸5 min.扩增反应结束后,对其产物进行琼脂糖电泳检测分离,切胶后,用0.6倍的Agencourt AMPure XP磁珠对DNA进行纯化回收,精确定量回收产物并进行测序（Qubit 2.0 DNA检测试剂盒）.
1.4序列数据分析
DNA测序平台使用Illumina Miseq,对测序的原始数据进行质量控制（QC）,除原始数据接头序列（选用1.2.1 版Cutadapt软件）,然后进行序列拼（采用0.9.6版Pear软件）,去除嵌合体和非特异性扩增序列（选择4.2.40版Uchime软件）,通过blastn进行同源比对,最终获得高质量DNA序列.对序列进行聚类分析（采用5.2.236版Usearch）,依据相似性进行划分,≥97%为同一分类操作单元（OTU）,统计各样本的OTU数（R 1.6.16版VennDiagram package）,将各样本独有的和共有的OTU数进行Venn作图.计算各样本的Simpson、Chao1、Shannon、Ace指数（1.30.1版Mother软件）,然后做曲线图（R软件）,分析样本微生物群落的Alpha多样性.对各样品进行物种分类（2.12版RDP classifier软件）,即对RDP分类阈值≥80%的序列进行门、纲、目、科、属各阶层分类（Naive Bayesian assignment算法）,分析每个样本各分类层级水平上的群落组成,对物种分类学统计结果进行作图（R软件）.
2结果与分析
2.1数据质控及测序深度
经测序分析获得健康植株和感染枯萎病植株根际土壤真菌的基因序列分别为163 516、188 072条.经质控和筛选优化处理后,感染枯萎病植株最终获得145 083条优质序列,序列平均长度为419 bp;健康植株最终获得140 493条优质序列,序列平均长度为420 bp.稀释曲线分析显示（图1）,当序列大于10 000时,随着测序数量的增加,Shannon指数稀释曲线趋于平缓,说明测序数据量合理,可用于整个真菌的群落结构.
2.2OTU聚类分析
在97%相似度水平对样品序列进行OTU聚类,健康植株样品共鉴定出真菌33个门、70个纲、121个目、196个科、232个属、386个种和1 901个OTU;感染枯萎病植株样品共鉴定出真菌34个门、68个纲、107个目、175个科、212个属、350个种和1 817个OTU（表1）.
Venn图分析结果（图2）表明,健康和感染枯萎病植株根际真菌共享的OTUs为1 120个,而健康植株根际真菌特有的OTUs为781个,占其总数41.08%,感染枯萎病植株根际真菌特有的OTUs为697个,占其总数的38.36%.可见,健康辣椒植株根际土壤真菌特有的OTUs略高于感染枯萎病植株,感染枯萎病植株与健康植株根际土壤真菌群落有一定的差异.
2.3真菌多样性指数
ACE、Chao指数用于表示样品真菌群落丰富度,Shannon、Simpson指数用于表示样品真菌群落多样性,Coverage用于表示样品测序的覆盖度.其中,Simpson指数值越大,说明群落多样性越低,其余指数值越大,说明相应的群落丰富度和多样性越高.α多样性分析表明（表2）,健康植株根际土壤真菌群落多样性高于感染枯萎病植株.
2.4真菌群落基本组成和结构
在门分类水平上（图3）,健康植株根际土壤真菌优势门是子囊菌门（Ascomycota）、被孢霉门（Mucoromycota）和脊椎动物门（Vertebrata）,其中,子囊菌门的丰度最高,为18.58%;感染枯萎病植株根际土壤真菌优势门是子囊菌门、绿藻门（Chlorophyta）和被孢霉门,其中子囊菌门的丰度最高,为38.23%,说明子囊菌门是主要优势菌门;其他真菌门相对丰度较低,健康的被孢霉门和脊椎动物门丰度分别是7.87%和5.15%,感染枯萎病的绿藻门和被孢霉门丰度分别是8.36%和5.55%.
在属分类水平上（图4）,健康植株根际土壤真菌的群落优势属是被孢霉菌属（Mortierella）、假裸囊菌属（Pseudogym-noascus）和鐮刀菌属（Fusarium）,而感染枯萎病植株根际土壤真菌的群落优势属是红曲霉菌属（Monascus）、假裸囊菌属和镰刀菌属;健康植株的被孢霉菌属相对丰度是6.79%,比感染枯萎病植株增加了2.40个百分点,健康植株的假裸囊菌属相对丰度是6.53%,比感染枯萎病植株下降了3.33个百分点,健康植株的镰刀菌属相对丰度是5.07%,比感染枯萎病植株下降了3.67个百分点,健康植株的红曲霉菌属相对丰度是1.1%,相较于感染枯萎病的植株下降了11.42个百分点.
3结论与讨论
本研究通过Illumina Miseq测序技术分析健康辣椒和和感染枯萎病辣椒根际土壤真菌群落结构组成和多样性,测序数据合理.α多样性分析表明,健康植株根际土壤的Shannon、ACE和Chao指数均高于感病植株,而Simpson指数低于患病植株,说明健康植株根际土壤真菌群落多样性高于感病植株根际土壤真菌群落多样性.研究表明,生态系统微生物多样性越高,系统的结构组成越复杂,稳定性也相对较高,土壤微生物群落结构的稳定性和多样性与植物正常生长发育及病害防治有着紧密的联系[17].OTU聚类分析表明,健康植株根际真菌特有的OTU占其总数的41.08%,而枯萎病感病植株根际真菌特有的OTU占其总数的38.36%,健康辣椒植株根际土壤真菌特有的OTU略高于感染枯萎病植株,说明真菌群落多样性的改变可能是辣椒感染枯萎病的特征之一.
真菌群落结构组成分析发现,在门水平上,健康植株根际土壤真菌最优势门是子囊菌门,其次是被孢霉门和脊椎动物门;感病的最优势门同样是子囊菌门,其次是绿藻门和被孢霉门.自然界中子囊菌门是已知真菌中最大的门,已知种类超过64 000种.研究表明,有许多种类的子囊菌是重要的植物病原菌,可以引起植物严重病害,子囊菌的营养方式有腐生、寄生和共生,寄生植物可引起植物病害[18-20].本研究发现健康植株根际土壤真菌群体中子囊菌门的丰度比枯萎病感病植株的丰度低19.65个百分点.本研究中,健康植株根际土壤中被孢霉门的丰度比感病的高2.32个百分点,脊椎动物门健康植株度比感病植株的丰度高1.07个百分点,而绿藻门丰度比感病的低4.41个百分点.被孢霉菌是一类重要的低脂类和高脂类真菌,同时也是产生物柴油的理想菌种[21].在属水平上,健康植株根际土壤真菌群落最优势属是被孢霉菌属,相对丰度是6.79%,比枯萎病感病植株增加了2.40个百分点,患病植株根际土壤真菌的群落最优势属是红曲霉菌属,相对丰度是12.52%,约是健康植株的11.4倍.研究发现,一些被孢霉菌属能够产生和利用多种脂肪酸,在膳食补充剂生产和生物燃料生产中具有重要的工业价值[22].红曲霉菌嗜酸,大多出现在乳酸自然发酵的基质中,其具有抑菌、抗癌和提高免疫力的能力[23-24].研究发现,假裸囊菌是嗜低温真菌,具备特殊的生理代谢特征和防御机制,能够适应极端的环境[25].镰刀菌属是植物枯萎病发生的重要病原菌,影响植株的正常生长.薛 超[26]研究表明,镰孢菌属是香蕉枯萎病植株根际土壤中的主要类群,在枯萎病植株土壤样品中的相对丰度比健康植株高1.5个百分点.本文患病植株的假裸囊菌属和镰刀菌属相对丰度分别是9.86%和8.74%,分别比健康植株增加了3.33个百分点和3.67个百分点,与前人研究一致.
利用Illumina Miseq高通量测序技术对健康和感染枯萎病辣椒植株根际土壤样品的测序分析结果表明,感病植株根际土壤真菌群落多样性降低且群落结构发生改变,其中镰刀菌属（Fusarium）数量增加是辣椒枯萎病患病的主要特征.
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