简介:该文是关于登革热和疫情专科开题报告范文与检测方法有关论文范文文献.
摘 要：登革热是一种主要分布在热带和亚热带地区的急性虫媒传染病,传染性极强.因此,快速准确的对登革热疑似病例进行有效的检测在疫情监测和防控工作中至关重要.本文就登革热病原学、血清学检测方法优缺点进行分析,以期为指导临床快速、准确、有效地检测登革热,提高登革热的检出率,避免出现误诊、漏诊及延诊.
关键词：登革热;标本;检测
Abstract：Dengue fever is an acute vector-borne infectious disease mainly distributed in tropical and subtropical regions, and is highly contagious. Therefore, rapid and accurate detection of suspected cases of dengue fever is very important in epidemic surveillance and prevention. This http://127.1.1.1:801/xdl.php?url等于http://gzslib.vip.qikan.com/Text/article analyzes the advantages and disadvantages of dengue fever etiology and serological detection methods, with a view to guiding clinical rapid, accurate and effective detection of dengue fever, improving the detection rate of dengue fever, and oiding misdiagnosis, missed diagnosis and extended diagnosis.
Key words：Dengue fever;Specimens;Detection
登革热（dengue fever）是一种主要分布在的热带和亚热带地区的急性虫媒传染病,主要传播媒介为埃及伊蚊和白纹伊蚊.被具有传染性的伊蚊叮咬后,3～14 d出现症状,在登革热高度易感地区,单个输入的病例便可引发流行[1].根据世界卫生组织的公布,在过去50年中,登革热的发病率增加了30倍[2].目前估计每年在100多个国家发生高达5000万至1亿人感染登革热[3],还有约3亿不表现症状的隐性感染者[4],因此登革热被WHO列入2019年世界健康十大威胁之一.如何快速准确的对登革热疑似病例进行有效的检测,这在疫情的监测和防控工作中至关重要.本文就登革热病原学、血清学检测方法优缺点进行综述,为登革热的科学防控提供帮助.
1病原学检测
1.1登革病毒分离培养 登革病毒感染检测的金标准是病毒分离培养方法,主要包括乳鼠脑内接种法、细胞培养法和蚊虫接种法.在实践中由于C6/36白纹伊蚊细胞对登革病毒十分敏感,登革病毒培养分离多采用C6/36白纹伊蚊细胞进行培养,根据细胞病变现象,应用间接免疫荧光试验进行检测.这种方法不但能确诊登革病毒感染,而且还能鉴别出不同的血清型[5].通常登革病毒感染者发热的2～5 d为病毒血症期,如发病4～5 d后再进行C6/36细胞培养分离登革病毒则一般需要5～10 d[6],无法实现早期快速诊断的目的,容易造成延诊.另外,该实验方法对样本的收集、冷藏、运输的过程要求严格,对实验人员的操作水平及相关仪器设备要求也都较高,故而该方法并不是十分适合疫情类标本的检测,同时其灵敏度仅为40.5%[7],因此临床检测中通常采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）等快速诊断方法代替它.
1.2 RT-PCR技术检测登革病毒RNA及型别鉴定 PCR技术是利用双链DNA分子碱基配对原则,在一定条件下扩增DN段的体外扩增方法.登革病毒含RNA基因组,因此PCR前需经过逆转录酶作用,合成第一条cDNA链（RT）,再进行扩增（PCR）,即RT-PCR.设计一对通用引物可扩增登革病毒组基因,在设计不同型登革病毒的引物对时,可扩增出不同的血清型病毒的基因产物.根据基因扩增产物的片段大小可判断是否是登革病毒甚至判定出某一型的登革病毒[8].RT-PCR是一种敏感性高、特异性强、重复性好的检测方法.在登革病毒感染的早期,可以用这种方法对登革病毒进行早期检测以及登革病毒型别的鉴定,这对分析登革病毒的传播、变异有重要的意义[9],是目前快速诊断登革热的最好方法之一.RT-PCR 能够直接检测病原体的靶核酸,是病毒物质快速检测的重要工具[10],它可定性或定量检测登革热病人早期血清中的登革病毒,与其他检测方法相比,其可以提前 5～8 d 检测出患者在窗口期的感染情况.另外,该方法操作简单、能进行分型,在登革病毒感染后的10 d内均可采用,具有比病毒分离法更好的灵敏度（48.4%～98.2%）,对同一患者的不同标本进行检测时,全血检测的敏感度为90.0%,但血清或血浆检测的敏感度相对较低为62.0%[11,12].Waggoner 等[13]研究报道,采用一对通用引物从血清样品中扩增出登革热病毒,RT-PCR检出率为97.0%,敏感性及特异性分别为91.4%和95.4%.
登革热血症期较短,对患者急性期样本进行核酸检测时,发病1～5 d 的登革热核酸阳性率为75%～100%[14],进入恢复期（发病6～10 d）的病毒核酸阳性率则快速降低,5 d后采集的血液标本中登革热核酸检出率低于45.8%[15],8 d后检出率20%左右[16].虽然部分患者在第10天仍然可以检出核酸,这可能是这部分患者自身免疫力较差或伴有基础病变,影响了病毒的及時清除,导致体内病毒血症持续时间延长[17].此外,RT-PCR检测结果不能判断所检测的标本是否为二次登革病毒感染的标本,该法要求的检测技术含量高,费用昂贵,并不适合基层实验室采用,而且在实际操作中影响检测结果的因素也比较多,如样本收集、处理、运送以及保存质量均会影响检测结果的准确性;样本在提取过程中操作不当容易交叉污染,造成假阳性的检测结果;阳性对照和扩增产物的泄漏,也会导致假阳性结果;试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现的假阴性或定量检测不准确的结果.
2血清学检测
2.1登革病毒NS1抗原检测 登革病毒NS1抗原检测采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验（该法临床考核样品灵敏度100.00%,特异性98.79%）,利用包被登革病毒抗体的板条与样品中的登革病毒NS1抗原结合,再加入酶标试剂进行第二次温育,当样品中存在登革病毒NS1抗原时将形成“包被抗体-抗原-酶标抗体”复合物,加入显色剂后,复合物上连接的HRP催化显色剂反应,生成蓝色产物,终止反应后,则变为.如样品中无登革病毒NS1抗原时则为阴性不显色,但此阴性并不排除登革病毒感染的可能,必须结合临床信息进行分析,它不能作为临床诊断的唯一依据.
NS1抗原是登革病毒的一种非结构糖蛋白,大量存在于感染细胞的表面,可作为早期登革病毒感染的标志性抗原.人感染了登革病毒后,经过3～15d（通常5～8 d）的潜伏期后,临床表现主要为“三联症”：发热、皮疹、疼痛,抗体反应会因宿主的免疫差异而异.首次感染登革病毒的病例会产生最初的反应,其特征是特异性抗体的缓慢上升,发病第1天开始,血浆内就出现特异性NS1抗原,且早于IgM抗体[18].酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原无论是初次感染还是二次感染,在发病的9 d内均可以检测,个别可以持续到18 d.2～5 d内患者NS1抗原达到峰值,5 d后逐渐下降.该检测方法适用于登革病毒感染急性期的检测.据Huang CH等[14]对确诊患者急性期样本检测的报道,酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原,阳性检出率达68.37%,PCR检测阳性率为71.94%,证实了酶联免疫法检测NS1抗原可用于登革病毒感染急性期的检测.
2.2登革病毒IgM抗体检测 根据抗原抗体特异性结合的原理,检测血清中的IgM抗体,显色程度和特异性IgM 抗体含量呈正比.IgM抗体阳性,表示患者新近感染登革病毒,适用于登革病毒早期诊断.有研究表明此法检测敏感性为 61.5%～99.0%,特异性可达79.9%～97.8%,敏感性和特异性与样本采集时间直接相关[19].登革病毒IgM抗体在感染后3～5 d即可出现,1～2周可以上升到抗体最高数值,之后抗体水平程下降趋势,2～3个月内消失.首次感染登革病毒的患者,IgM 抗体升高明显,大约50%的病例在发病3～5 d后可以检测到登革热IgM抗体,5 d后80%的病例可以检测到IgM抗体,10 d后99%的病例可以检测到IgM抗体.研究表明,采血时间对登革病毒IgM抗体的检出率有较大影响.另外,登革病毒二次感染者IgM抗体水平远低于初次感染,约20%～30%的患者在二次感染登革病毒后10 d未能检测到IgM抗体.
2.3登革病毒IgG抗体检测 根据抗原抗体特异性结合的原理,显色的程度与特异性IgG抗体含量呈正比,检测血清中的登革病毒IgG抗体也可用于登革热的筛查.研究显示,登革病毒IgG抗体检测的灵敏度为95.93%,特异度为 96.86%.IgG抗体在发病1周后可检测出最低数值,通常发病10 d后可以检测到;在此之后,IgG抗体滴度会缓慢上升,IgG抗体可维持数年甚至持续终生.若患者在发病1周内血清中检出较高数值的特异性IgG抗体,提示可能是登革病毒的二次感染或是曾感染过其他病毒.IgG 抗体的检测不仅可以对初次感染登革病毒的患者进行确诊,也可以对二次感染患者进行判断.二次感染登革病毒的患者,发病后1～2 d IgG抗体可迅速上升到远远高于初次感染的水平,故可以通过检测登革病毒 IgG 抗体对二次感染的患者进行诊断,并根据抗体滴度高低对近期感染或继往感染进行判断.
3初次感染和二次感染的判断
初次感染和二次感染的判断依据：对于发病<7d的标本,IgM抗体阳性而IgG抗体阴性则判断为初次感染,IgM和IgG抗体都为阳性或IgM抗体阴性而IgG抗体阳性同时登革病毒核酸检测阳性则判断为二次感染.而发病≥7 d的标本,IgM抗体阳性而IgG抗体阴性或IgM和IgG抗体同时阳性但IgM/IgG比值>1.2的则判断为初次感染,IgM和IgG抗体同时阳性但IgM/IgG比值小于1.2的则判断为二次感染[20].
4联合检测
疑似登革热病例疫情标本,根据病例流行病学调查情况,检测登革病毒核酸和抗体IgM：病例发病日期5 d内采集的血液标本若核酸检测结果为阴性,则再测特异性抗原NS1,若特异性抗原NS1结果还是阴性,但患者临床症状典型（包括重症）则必须再进行抗体IgG检测.病例发病日期>5 d采集的血清标本则测抗体IgG.采用聯合检测方法判断结果,以任意一种检测方法结果阳性则判定为联合检测结果阳性.联合检测可以提高登革热阳性检出率[21].据杨笑涵等[22]报道,在感染登革病毒早中期,核酸联合特异性NS1抗原检测以及后期特异性IgM抗体联合IgG抗体检测的检出率可以达到100%.
5总结
血清学检测和核酸检测是目前实验室常用的快速、简便、特异的登革热检测方法.这两类方法常用于登革热监测和登革热疫情标本检测.由于这两类方法的敏感性和特异性与样本采集时间直接相关,加之患者的个体差异,以及每种检测方法都有最低检测限,所以登革热存在一定的漏诊问题.血清学检测不能区别登革血清型,但可以判断是否感染登革病毒和初步判断登革病毒感染的时间以及是否为二次感染.核酸检测可确定登革热血清型,但难以判断登革病毒感染的时间以及是否为二次感染.由于登革热临床表现的复杂性和病例身体免疫状况的差异以及每种检测方法的局限性,应将联合检测方法中任意一种检测方法检出阳性的标本判定为联合检测阳性.联合检测方法提高了登革病毒检出率,解决了现在登革病毒存在的易误诊、延诊、漏诊的问题,为处置登革热疫情赢得时间.同时根据检测结果来初步判断登革病毒感染的时间以及是否为二次感染,为医疗工作者对患者采取登革病毒治疗的方案作出重要的参考.
综上所述,对疑似登革热病例疫情标本,应根据病例流行病学调查情况,选择恰当的检测方法,必要时可采用联合检测方法,以便快速、准确、有效的检测登革热病毒,提高检出率,避免误诊、漏诊、延诊,做好登革热监测及疫情防控工作.
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编辑/王朵梅
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