简介:关于基因组提取方面的的相关大学硕士和相关本科毕业论文以及相关基因组提取论文开题报告范文和职称论文写作参考文献资料下载。
王学治,翟 强,凌兴泽,陈旭辉,曲 波
（沈阳农业大学生物科学技术学院,沈阳 １１０８６６）
摘 要：利用改良的ＣＴＡＢ法、ＳＤＳ法及斑迹抽提法提取三裂叶豚草（Ａｍｂｒｏｓｉａ ｔｒｉｆｉｄａ Ｌ．）不同部位的基因组ＤＮＡ.结果表明,改良的ＣＴＡＢ法提取三裂叶豚草韧皮部基因组ＤＮＡ的提取效果最好.
关键词：三裂叶豚草（Ａｍｂｒｏｓｉａ ｔｒｉｆｉｄａ Ｌ．）；提取；基因组ＤＮＡ；改良的ＣＴＡＢ法
中图分类号：Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０13）06－1447-03
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｏn Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｂｒｏｓｉａ ｔｒｉｆｉｄａ
ＷＡＮＧ Ｘｕｅ－ｚｈｉ,ＺＨＡＩ Ｑｉａｎｇ,ＬＩＮＧ Ｘｉｎｇ－ｚｅ,ＣＨＥＮ Ｘｕ－ｈｕｉ,ＱＵ Ｂｏ
（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ, Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ, Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０８６６,Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ, ＳＤＳ ａｎｄ Ｂａｎｊｉ method ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ from ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ Ａｍｂｒｏｓｉａ ｔｒｉｆｉｄａ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔs ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ extracting ＤＮＡ from ｐｈｌｏｅｍ of Ａ. ｔｒｉｆｉｄａ using ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ method ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： gｉａｎｔ ｒａｇｗｅｅｄ（Ａｍｂｒｏｓｉａ ｔｒｉｆｉｄａ Ｌ．）； ｅｘｔｒａｃｔ； ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ； ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ
三裂叶豚草（Ａｍｂｒｏｓｉａ ｔｒｉｆｉｄａ Ｌ．）为菊科（Compositae）豚草属（Ambrosia）一年生粗壮草本植物,高５０～１２０ ｃｍ,有时可达１７０～２００ ｃｍ,叶掌状三裂,有时五裂,几乎全部对生［１］.三裂叶豚草原产于北美洲,生命力、竞争力极强,传播途径多,繁殖系数大,分布范围广,危害大,难以治理,对农业生产和生态环境已经造成了巨大危害［２-4］.２０１１年,本课题组调查时发现三裂叶豚草在辽宁、上海、黑龙江、吉林、北京等省市均有分布,并且在形态上有一定差异.三裂叶豚草分子水平的遗传变异研究可为探索其传播规律与途径提供一定依据.
本研究对三裂叶豚草基因组ＤＮＡ提取方法及不同部位基因组ＤＮＡ提取效果进行比较研究,为获取更高质量的ＤＮＡ提供一定参考.
１ 材料与方法
１．１ 材料
三裂叶豚草成熟植株２０１１年１０月采集自沈阳农业大学科研基地,取其叶片、茎、韧皮部、花序轴置于装有变色硅胶的密封袋中,干燥保存备用.
１．２ 试剂
改良的ＣＴＡＢ提取缓冲液［５,６］：５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）,５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ,１．６ ｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ,２％ ＣＴＡＢ；ＳＤＳ提取缓冲液［７］：５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）,５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ,１．４ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ,２％ ＳＤＳ；斑迹抽提缓冲液［８］：１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）,１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ,１００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ,２％ＳＤＳ,０．０３９ ｍｏｌ／Ｌ二硫苏糖醇.
１．３ 方法
１．３．１ 样品的处理 称取０．０１５ ｇ三裂叶豚草干燥叶片,放入研钵中加入石英砂和液氮研磨.将研磨后的粉末转移至２ ｍＬ离心管中,分别加入１ ｍＬ改良的ＣＡＴＢ提取缓冲液和ＳＤＳ提取缓冲液.斑迹抽提法的样品处理则不需研磨,直接将样品放入２ ｍＬ离心管中,加入斑迹抽提缓冲液.
１．３．２ 基因组ＤＮＡ的提取 将２ ｍＬ离心管放入水浴锅中６５ ℃水浴１ ｈ,斑迹抽提法则需水浴３ ｈ；１ ２００ ｒ／ｍｉｎ常温离心１０ ｍｉｎ取上清；加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（体积比２５∶２４∶１）混合液,振荡混匀后,１ ２００ ｒ／ｍｉｎ常温离心１０ ｍｉｎ取上清；加入等体积的氯仿-异戊醇（体积比２４∶１）混合液并混匀,１ ２００ ｒ／ｍｉｎ常温离心１０ ｍｉｎ取上清,重复两次；加入２．５倍体积预冷的无水乙醇,－２０ ℃放置３０ ｍｉｎ,１ ２００ ｒ／ｍｉｎ常温离心１０ ｍｉｎ留沉淀；加入５００ μＬ ７０％乙醇洗涤３次；干燥２ ｈ后加入１００ μＬ ＴＥ缓冲液溶解ＤＮＡ,放置于－２０ ℃保存.试验均重复３次.
１．３．３ 不同组织基因组ＤＮＡ的提取 采用改良的ＣＡＴＢ法分别提取三裂叶豚草的成熟叶片、茎、韧皮部、花序轴等组织部位基因组ＤＮＡ,提取方法同“１．３．２”.试验均重复３次.
１．３．４ 基因组ＤＮＡ样品质量的检测 用紫外分光光度计检测提取样品的基因组ＤＮＡ纯度,根据Ａ２６０ ｎｍ／Ａ２８０ ｎｍ判断ＤＮＡ纯度；通过１％琼脂糖凝胶电泳检测提取样品的基因组ＤＮＡ,并用紫外凝胶成像仪观察并拍照记录.
２ 结果与分析
２．１ 不同提取方法提取三裂叶豚草叶片基因ＤＮＡ的比较
用紫外分光光度计检测提取样品的基因组ＤＮＡ纯度,根据Ａ２６０ ｎｍ／Ａ２８０ ｎｍ来判定ＤＮＡ纯度.当Ａ２６０ ｎｍ／Ａ２８０ ｎｍ接近１．８０时,ＤＮＡ纯度较高,当Ａ２６０ ｎｍ／Ａ２８０ ｎｍ＜１．８０表明有蛋白等杂质,Ａ２６０ ｎｍ／Ａ２８０ ｎｍ接近２．００时表明ＲＮＡ含量较高,ＤＮＡ降解较多［９］.改良的ＣＴＡＢ法、ＳＤＳ法、斑迹抽提法提取三裂叶豚草叶片基因组ＤＮＡ的Ａ２６０ ｎｍ／Ａ２８０ ｎｍ分别为１．８２、１．７８和１．９６（表１）.结果表明,改良的ＣＴＡＢ法提取的基因组ＤＮＡ纯度较高；ＳＤＳ法提取的ＤＮＡ含有较多蛋白等杂质；斑迹抽提法提取的ＤＮＡ降解严重.在抽提液颜色和ＤＮＡ颜色上,改良的ＣＴＡＢ法抽提液为绿色,沉淀后的ＤＮＡ呈白色,表明此方法去除酚类等杂质效果很好；而ＳＤＳ法与斑迹抽提法的抽提液为褐色,沉淀后的ＤＮＡ均呈深褐色,表明这两种方法去除酚类等杂质效果较弱.通过1%琼脂糖凝胶电泳检测（图１）,改良的ＣＴＡＢ法提取的基因组ＤＮＡ无明显拖尾,ＤＮＡ条带清晰,效果最好；ＳＤＳ法提取的基因组ＤＮＡ点样孔较亮,ＤＮＡ有明显拖尾,表明样品含有较多蛋白质、多糖等杂质,提取效果较差；斑迹抽提法提取的基因组ＤＮＡ无明显ＤＮＡ条带,ＤＮＡ几乎全部降解,效果最差.改良的ＣＴＡＢ法提取的ＤＮＡ纯度高、杂质少,是三裂叶豚草基因组ＤＮＡ的最佳提取方法.
２．２ 三裂叶豚草不同组织部位基因组ＤＮＡ提取结果的比较
利用改良的ＣＴＡＢ法提取三裂叶豚草成熟叶片、茎、韧皮部、花序轴的基因组ＤＮＡ,经分紫外光光度计检测,Ａ２６０ ｎｍ／Ａ２８０ ｎｍ分别为１．８２、１．８７、１．８６、１．８９（表２）.利用此方法提取的不同组织部位基因组ＤＮＡ质量均较好,韧皮部提取纯度稍高于其他部位；不同组织部位提取基因组ＤＮＡ的抽提液颜色及沉淀后的ＤＮＡ颜色有差异,成熟叶片与花序轴基因组ＤＮＡ抽提液为深绿色,含酚类等杂质较多；茎基因组ＤＮＡ抽提液颜色为绿色,含酚类等杂质相对较少；韧皮部基因组ＤＮＡ抽提液颜色最淡,含酚类等杂质最少.
对不同组织部位提取的基因组ＤＮＡ进行1%琼脂糖凝胶电泳检测（图2）.结果表明,韧皮部基因组ＤＮＡ无明显拖尾,ＤＮＡ条带清晰,韧皮部提取质量高杂质少；茎和成熟叶片点样孔较亮,ＤＮＡ有少量拖尾,茎和成熟叶片含杂质相比韧皮部较多,ＤＮＡ质量稍差；花序轴基因组ＤＮＡ条带较弱,也有少量拖尾,花序轴提取基因组ＤＮＡ含量较少,杂质较多,质量最差.提取三裂叶豚草基因组ＤＮＡ时,韧皮部最好,茎和成熟叶片稍差,花序轴效果最差.
基因组提取方法:科技学院生物实验中心 分子生物学实验—植物基因组DNA提取
３ 小结与讨论
３．１ 提取方法
本研究对ＣＴＡＢ法进行了改良,高盐能使ＤＮＡ和多糖分离,使其较易析出［１０］,相比普通ＣＡＴＢ法,ＣＴＡＢ缓冲液中ＮａＣｌ的浓度提高到１．６ ｍｏｌ／Ｌ.植物材料中普遍含有多酚类物质,容易氧化成棕褐色,与ＤＮＡ结合形成不溶物,导致ＤＮＡ纯度下降,不溶物一旦形成就很难去除.酚类化合物在植物材料中存在十分普遍,所以在抽提缓冲液中加入一定量的β－巯基乙醇［１１］效果较为明显,但是过量的β－巯基乙醇能够使ＤＮＡ断裂.经过重复试验,在１ ０００ μＬ缓冲液中加入２５ μＬ β－巯基乙醇较为合适.
３．２ 提取部位
植物提取基因组ＤＮＡ的组织取材以幼叶效果最好.但是受限于季节和野外采样时间等因素影响,只能取到成熟叶片,成熟叶片次生代谢物质较多,提取到的ＤＮＡ质量差.本研究对三裂叶豚草的其他组织（茎、韧皮部、花序轴）取样提取基因组ＤＮＡ.韧皮部提取到的基因组ＤＮＡ质量最好,茎、成熟叶片次之,花序轴最差.韧皮部提取的ＤＮＡ沉淀为白色,易溶于ＴＥ缓冲液.琼脂糖凝胶电泳检测条带清晰,没有拖尾降解的现象,适合于代替幼嫩叶片作为基因组ＤＮＡ提取组织材料.
本研究中采用三裂叶豚草鲜样提取基因组ＤＮＡ,琼脂糖凝胶电泳检测ＤＮＡ条带很弱或没有条带.采用干样效果较好,可能是鲜样中酶的活性很高,在提取过程中易使ＤＮＡ降解,而干样细胞中含水较少,使酶的活性降低,甚至部分酶失活,于是研磨时释放出的酶对ＤＮＡ的影响较小,并且干样容易在室温长期保存,方便在交通不便利的野外取样运输［１２］.
参考文献：
［１］ 关广清． 豚草和三裂叶豚草的形态特征和变异类型［Ｊ］． 沈阳农学院学报,１９８５,１６（４）：９－１７．
［２］ 曲 波,吕国忠,杨 红．辽宁省外来入侵有害生物——杂草调查［Ｊ］． 沈阳农业大学学报,２００６,３７（４）：５７８－５９２．
［３］ ＮＯＲＳＷＯＲＴＨＹ Ｊ Ｋ, ＰＲＡＳＨＡＮＴ Ｊ, ＬＡＷＲＥＮＣＥ Ｅ, ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｉａｎｔ ｒａｇｗｅｅｄ （Ａｍｂｒｏｓｉａ ｔｒｉｆｉｄａ） ｉｎ Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ［Ｊ］． Ｗｅｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ,２０１０,２４（１）：６４－７０．
［４］ ＢＲＡＢＨＡＭ Ｃ Ｂ, ＧＥＲＢＥＲ Ｃ Ｋ, ＪＯＨＮＳＯＮ Ｗ Ｇ． Ｆａｔｅ ｏｆ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｉａｎｔ ｒａｇｗｅｅｄ（Ａｍｂｒｏｓｉａ ｔｒｉｆｉｄａ） ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ａｎｄ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ［Ｊ］． Ｗｅｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ,２０１１, ５９（４）：５０６－５１１．
［５］ ＤＯＹＬＥ Ｊ Ｊ． Ａ ｒａｐｉｄ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｓ ｏｆ ｆｒｅｓｈ ｌｅａｆ ｔｉｓｓｕｅ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ Ｂｕｌｌ,１９８７（１９）：１１－１５．
［６］ 曹文波,郑璐璐,谢文海． 一种提取植物基因组ＤＮＡ的方法——改良尿素法［Ｊ］． 华中师范大学学报（自然科学版）,２００８,４２（３）：４４８－４５１．
［７］ ＦＡＲＮＨＡＭ Ｍ Ｗ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ａｎｄ ｗｉｔｈｉｎ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｃｏｌｌａｒｄ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ａｎｄ ｌａｎｄｒａｃｅｓ ａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｒａｎｄｏｍｌｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Sｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Hｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Sｃｉｅｎｃｅ,１９９６,１２１（３）：３７４－３７９．
［８］ 徐 立,余茂德,鲁 成,等．桑叶总ＤＮＡ的斑迹抽提方法［Ｊ］．蚕业科学,２００５,３１（１）：１０７．
［９］ 张 丽,黄学琴,吴全忠,等．黑核桃叶片基因组ＤＮＡ提取方法比较研究［Ｊ］．中国农学通报,２０１１,２７（２８）：１２５－１２９．
［１０］ 马月萍,戴思兰．高盐沉淀ＣＴＡＢ法提取温室菊花基因组ＤＮＡ［Ｊ］．生物技术通报,２００９（７）：９０－９３．
［１１］ 秦艳玲,吴玉兰,李宗艳．改良ＣＴＡＢ法对西南牡丹总ＤＮＡ提取工艺的优化［Ｊ］．贵州农业科学,２０１１,３９（１１）：２３－２５．
［１２］ 吕 杰,马 媛,金 湘,等．硅胶干燥胡杨叶片ＤＮＡ提取与ＲＡＰＤ反应体系的建立［Ｊ］． 北方园艺,２０１１（１４）：１３１－１３４．
总结：本论文可用于基因组提取论文范文参考下载，基因组提取相关论文写作参考研究。
基因组提取方法引用文献:
[1] 毕业论文查重时实验方法提取dna
[2] 中药提取论文范文 关于中药提取论文例文2万字
[3] 提取论文范文 提取类在职毕业论文范文2万字
