《黄梁木环割促萌正交试验与混合效应模型分析》
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摘 要：【目的】开展黄梁木环割促萌正交试验并进行混合效应模型分析,为培育黄梁木高幼化程度无性繁殖材料及黄梁木优良种质资源保存和推广应用打下基础.【方法】以黄梁木成年大树为试验材料,设环割高度和宽度2个因素,环割宽度分别为2、3和4 cm及环割高度分别为20、30和40 cm 3个水平的正交试验,共9个处理（处理1～9）;环割后每隔1周调查并记录各处理的不定芽发芽数;利用双因素方差分析和线性混合效应模型,分析筛选黄梁木环割促萌最佳条件组合.【结果】处理1的平均发芽数最多,为6.38个,明显多于处理2、处理4、处理8和处理9,显著多于处理3、处理5、处理6和处理7（P<0.05,下同）.双因素方差分析结果显示,环割高度和环割宽度对发芽数影响不显著（P>0.05,下同）,但二者的交互作用对发芽数具有极显著影响（P<0.01）;线性混合效应模型分析结果表明,环割高度、环割高度×初始胸径和环割宽度×初始胸径对发芽数有显著影响,环割宽度、初始胸径和环割宽度×环割高度对发芽数无显著影响.【结论】经双因素方差分析和线性混合效应模型分析,黄梁木环割促萌的最佳条件为环割高度20 cm、环割宽度2～3 cm.
关键词： 黄梁木;环割;正交试验设计;线性混合效应模型
0 引言
【研究意义】黄梁木（Neolamarckia cadamba）又名团花树,是茜草科（Rubiaceae）团花属（Neolamarc-kia）高大常绿或落叶速生乔木（罗献瑞,1999）,已在园林绿化中广泛应用（郑永光和徐英宝,2005）.其干形通直圆满,木材纹理通直且结构均匀,可作优质速生工业用材（苏光荣等,2007）.黄梁木富含生物碱、黄酮、萜类及单宁等物质（Pandey and Negi,2016）,具有抗菌消炎等作用（Pandey and Negi,2018;李晓琳等,2019）;成熟的黄梁木果实具有芳香味,可用作饮料原料（Pandey et al.,2018）;枝叶可用作家畜饲料添加剂（王益等,2018）.黄梁木在华南地区人工种植面积已超过270 ha,且仍在不断扩大（黄浩等,2016）,造林所需优质种苗处于紧缺状态.但黄梁木优质种苗主要利用优良单株通过无性繁殖获得,选择周期较长（6年以上）（Rahayu et al.,2014）,而其離地面10 m以上的第1活枝成熟效应高、幼化程度低,不宜用作无性系繁育.因此,开展黄梁木环割促萌研究,对黄梁木优质种苗的快速繁殖及推广种植具有重要意义.【前人研究进展】周双云等（2004）研究表明,采用50～60 ℃温水浸泡黄梁木种子可有效提高萌发率.潘瑞炽（2008）研究认为,细胞分裂素主要在根尖合成后往上运输,能促进侧芽生长.林碧珍等（2009）、邓小梅等（2012）研究显示,以黄梁木茎段为外植体的组培快繁技术已获得成功.Rahayu等（2014）研究发现,黄梁木无性繁殖所用材料必须从优良单株上取得才能保证造林的经济效益,但优良单株需从6年生以上的大树中选择,摘取枝条非常困难且所采集的枝条还存在成熟效应高、幼化程度低等问题.Li等（2019）研究认为,利用无菌种子苗作为组培快繁材料会造成子代遗传分化,不能保证造林的经济效益和生态效益.在果树栽培管理方面,陈雪华等（2012）研究显示,环割可促进荔枝和龙眼开花结实,提高产量;王军等（2012）通过在不同时期进行环割、环扎和环刻试验,初步掌握了芒果树环割、环扎和环刻的技术要点.【本研究切入点】目前,尚无可安全方便地获得野外黄梁木优良单株且幼化程度高无性繁殖材料的途径,而关于林木环割促萌技术的相关研究也鲜见报道.【拟解决的关键问题】对黄梁木大树进行环割处理,促进其树干基部不定芽快速萌发,利用正交试验设计并采用线性混合效应模型对试验结果进行分析,探索黄梁木环割促萌的最优条件,为培育黄梁木高幼化程度扦插、组培繁殖材料及为黄梁木种质资源的保存和推广应用打下基础.
1 材料与方法
1. 1 试验材料
试验材料为前期研究（阙青敏等,2015）收集黄梁木混合种子培育的实生苗木,2015年7月造林,株行距2 m×1 m,采用穴耕栽植,穴规格为30 cm×30 cm×30 cm.试验地位于广州市华南农业大学启林科研基地（东经113°37′,北纬23°16′）,海拔42.3 m,属亚热带季风气候区,年均气温21.9 ℃,年均降水量1696.5 mm,年均日照时数1800 h,土壤质地为壤土.
1. 2 试验方法
1. 2. 1 试验设计 环割试验设环割宽度和环割高度2个因素,每因素设3个水平,其中环割宽度分别为2、3和4 cm,环割高度分别为20、30和40 cm,进行L9（32）正交试验设计（表1）,共9个处理,每处理30个重复.于2018年5月17日按照正交试验设计表进行环割处理,同时测量环割植株的胸径.随后每隔1周观察记录不定芽萌发情况及伤口愈合情况.
1. 2. 2 线性混合效应分析 采用线性混合效应模型y等于Xβ+Zu+ε对试验数据进行线性混合效应分析.式中,y为发芽数,β为固定效应（试验号、环割高度、环割宽度、环割高度×环割宽度）,u为随机效应（胸径）,ε为误差,X为固定效应的设计矩阵,Z为随机效应的设计矩阵.
1. 3 统计分析
试验数据采用Excel 2013进行整理,以Duncan’s新复极差法进行多重比较和双因素方差分析,在R version 3.5中利用lme4包对数据进行线性混合效应模型拟合（Bates et al.,2015）并作方差分析和回归分析,利用Sjstats包和lmerTest包对线性混合效应模型进行差异显著性检验（Kuznetsova et al.,2017）.
2 结果与分析
2. 1 不定芽发芽数的直观分析结果
经观察发现,黄梁木环割后20 d左右伤口基本愈合,且不再萌发不定芽,因此,本研究中的不定芽发芽数为环割后第21 d调查所得不定芽数（表2）.由表2可知,处理1不定芽发芽数（6.38个）最多,显著多于处理3、处理5、处理6和处理7（P<0.05,下同）;处理3和处理7的不定芽发芽数较少（分别为3.63和3.11个）,但与处理2、处理4、处理5、处理6和处理8无显著差异（P>0.05,下同）;处理1的初始胸径为8.21 cm,与处理3（8.68 cm）差异不显著,但二者的发芽数差异显著,而处理1与处理2（6.38 cm）的初始胸径差异显著,但其发芽数差异不显著,说明初始胸径与发芽数无必然的相关性.
由表2可知,当环割高度为20 cm时,随着环割宽度的增加,发芽数逐渐减少;当环割高度为40 cm时,发芽数随着环割宽度的增加而增加,与环割高度为20 cm时的变化趋势相反.当环割宽度为2 cm时,发芽数随着环割高度的增加而减少;当环割宽度为4 cm时,发芽数随着环割高度的增加而增加.可见,环割高度越高且环割宽度越宽时,发芽数越多,或者环割高度越低且环割宽度越窄时,发芽数越多.由于环割宽度为4 cm时母株伤口不能愈合（图1）,而环割宽度小于2 cm时伤口会迅速愈合导致无不定芽产生（图2）,因此,本研究选择环割高度（20 cm）低且环割宽度（2 cm）窄的组合为最佳环割促萌方式.
2. 2 不定芽发芽数的双因素方差分析结果
环割高度与环割宽度的双因素方差分析结果见表3.由表3可知,环割高度和环割宽度对发芽数均无显著影响,而环割高度与环割宽度的交互作用对发芽数有极显著影响（P<0.01,下同）.为此,对环割高度和环割宽度进行双因素方差分析,可直观地得出最佳环割组合（图3）：当环割高度为20 cm时,环割宽度选择2或3 cm均能获得最佳环割促萌效果.
2. 3 不定芽发芽数的线性混合效应分析结果
黄梁木环割促萌发芽数除受环割高度、环割宽度及二者的交互作用影响外,还可能受初始胸径影响.为此,本研究利用线性混合效应模型来解析初始胸径对发芽数的影响.在混合效应分析中,将处理号、环割高度、环割宽度及二者的交互作用作为固定效应,将初始胸径分别与处理号、环割高度、环割宽度的交互作用作为随机效应.模型拟合结果见表4.由表4可看出,所有模型的拟合效果均达极显著差异水平,但模型4和5的决定系数（R2）比模型1、模型2和模型3大,且P和赤池信息规则（AIC）比模型1、模型2和模型3小,说明模型4和模型5的拟合效果更佳;而模型4与模型5的R2等参数均相同,因此,需对其进行进一步比较分析,结果见表5.
由表5可知,在线性混合效应模型中添加或删除环割宽度因素,对模型不会造成显著影响,说明环割宽度对发芽数影响不显著.因此选择无环割宽度的模型5进行后续分析.
为进一步探究模型5中各因素对发芽数的影响程度,需对其中各因素进行差异显著性检验.由表6和表7可看出,环割高度对发芽数有显著影响,环割高度×环割宽度对发芽数影响不显著;随机效应中环割高度×初始胸径、环割宽度×初始胸径对发芽数均有极显著影响,而初始胸径对发芽数无显著影响.
为解析各因素对发芽数的影响趋势,提取模型进行回归分析.由表8可知,模型拟合效果极显著,当环割高度为20 cm（模型截距）时,平均发芽数为6.43个,当环割高度为30和40 cm时,估计值为负值,而此处的估计值即为模型中的斜率,说明环割高度越高,促萌效果越差.
3 讨论
本研究中,直观分析结果表明,黄梁木初始胸径对发芽数影响不显著,不能直观判断环割高度和环割宽度对发芽数的影响程度;双因素方差分析结果显示环割高度×环割宽度对黄梁木发芽数有显著影响,环割高度和环割宽度对发芽数的影响均不显著;线性混合效应分析结果显示,环割高度、环割高度×初始胸径及环割宽度×初始胸径对发芽数有显著影响,环割宽度、初始胸径和环割高度×环割宽度对发芽数影响不显著.说明直观分析、 双因素方差分析和线性混合效应分析结果存在差异,其中双因素方差分析能直观地给出最佳组合,而线性混合效应模型对挖掘潜在影响因素较有优势,与许崇华等（2017）对杉木树高—胸径模型的研究结果一致.
经过环割富集由下往上运输细胞分裂素可促进树干不定芽发生（潘瑞炽,2008）,因此,想在短时间内得到更多、幼化程度更高的不定芽,环割高度要越低越好.本研究选择的黄梁木环割高度最低为20 cm,一方面是因为黄梁木接近地面的树干具有板状根（罗献瑞,1999）,不方便环割操作,另一方面是因为越贴近地面通风越差及微生物越多（张明洋等,2018）,会加大伤口感染风险;环割宽度为2和3 cm的促萌效果较佳,环割宽度太宽会导致伤口不能愈合,致使母株死亡,环割宽度太窄会导致伤口迅速愈合,达不到促萌效果.
黄梁木生长旺盛期在每年的4—7月（罗献瑞,1999）,在这段时间内进行环割有利于萌发出更多不定芽,也便于缩短母株伤口愈合时间,从而减小对母株的伤害.此外,由于通风不良会导致微生物累积（张明洋等,2018）,在環割操作前,应清理母株周边的杂灌草,以加强空气流通减少伤口被病害感染的风险,并为新萌发的不定芽提供更多光照促进生长,缩短试验进程.与果树环割技术（陈雪华等,2012）相比,黄梁木环割技术操作简单,不对环割伤口进行额外处理也不会影响母树生长,能为黄梁木扦插、组织培养等取材提供充足且幼化程度高的繁殖材料,为黄梁木种质资源保存及推广应用打下基础.
4 结论
经双因素方差分析和线性混合效应模型分析,黄梁木环割促萌的最佳条件为环割高度20 cm、环割宽度2～3 cm.
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