简介:该文是高效液相色谱和烟草方面有关本科论文开题报告范文和高效类专升本毕业论文范文.
摘 要：为降低烟草中噁霉灵检测中的基质干扰,提高检测灵敏度和和稳定性,通过试验建立了以QuEChERS为样品前处理方法、液相色谱串联质谱仪为检测仪器的烟草中噁霉灵残留检测方法.样品加水浸润后,经丙酮提取、盐析试剂包除水、石墨化炭黑除杂后,采用Agilent ZORBAX 300SB-C8液相色谱柱（2.1 mm×100 mm,1.8 μm）分离,甲醇-水程序洗脱,ESI雾化,串联质谱MRM检测.结果发现,该方法在0.0025～0.0500 mg/L范围内线性良好,决定系数r2等于0.9996,定量检测限1.06 μg/L,回收率在90.8%～92.0%之间,相对标准偏差为5.1%.运用该方法测定烟草中的噁霉灵,操作简单,检测精度高,满足CORESTA对烟草农残检测的要求.
关键词：烟草;噁霉灵;超高效液相色谱串联质谱法
Abstract： In order to reduce matrix interference and improve detection sensitivity and stability, a method for determination of hymexazol residues in tobacco was established using QuEChERS as sample pretreatment method and liquid chromatography tandem mass spectrometer as detection instrument. The samples were extracted by acetone after moistened with water, then bytreated with salting-out reagent to remove water and purified by graphitized carbon black （GCB）. After separated by Agilent ZORBAX 300SB- C8 column （2.1 mm×100 mm, 1.8 μm） with methanol-water as the mobile phase,the extracts were detected by an electrospray ionization （ESI） tandem mass spectrometry in the multiplereaction-monitoring （MRM） mode. The results showed that good linearity was obtained in the range of 0.0025-0.0500 mg/L, the linear correlation coefficient （r2） was 0.9996, the quantitative detection limit was 1.06 μg/L, the recovery ratio was between 90.8%-92.0%, and the relative stantdard deviation was 5.1%. With simple operation and high detection accuracy, this method is suitable for hymexazol determination in tobacco, which meets CORESTA's requirements for tobacco pesticide residue detection.
Keywords： tobacco; hymexazol; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
随着消费者对健康问题的关注,农药残留成为卷烟安全性的重点关注指标之一.噁霉灵（3-羟基-5-异恶唑）作为土壤杀菌剂,在烟草、水稻、黄瓜、西瓜、甜菜等作物中广泛使用.噁霉灵毒性虽较低,但也存在农药残留问题,《食品中农药最大残留限量》国家标准明确要求噁霉灵在糙米和甜菜中的残留量不得高于0.50 mg/kg[1-2];烟草行业标准《烟叶农药最大残留限量》中规定噁霉灵在烟草中的最大残留（MRL）值为0.50 mg/kg,然而配套的YC/T405系列检测标准[3-7]中却缺少了噁霉灵相关检测方法.
目前报道的噁霉灵检测主要有气相色谱法[8-11]、电化学分析法[12-13]和液相色谱-紫外检测法[14-16].其中气相色谱法因噁霉灵具有热不稳定性,需经衍生化才能进入气相色谱仪分析,且操作复杂、检测误差大;采用电化学分析法测定噁霉灵时选择性差,检测灵敏度低,多用于工艺跟踪和成品的定量分析;而液相色谱-紫外检测法测定噁霉灵时杂质干扰较大,不适用于烟草等复杂基质样品的检测.
鉴于现有检测手段的不足,本文尝试对传统液相色谱检测方法进行改进,建立一种以QuEChERS样品前处理结合液相色谱串联质谱仪检测为核心的烟草中噁霉灵残留量检测方法.
1.材料与方法
1、1 仪器和试剂
高效液相色谱仪（Agilent1290,美国Agilent公司）;三重四级杆串接质谱仪（API5500,美国AB SCIEX公司）;超纯水仪（Milli-Q,美国Millipore公司）;漩涡混合振荡仪（VX-200,美国Labnet公司）;高速离心机（Sigma1-14,德国Sartorius公司）;电子天平（AG104型,感量：0.0001 g,瑞士Mettler Toledo公司）.
标准品：噁霉灵（Hymexazol）,純度>99.5%,国家标物中心,磷酸三苯酯（Triphenyl phosphate,TPP）,纯度>92%,德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）;N-丙基乙二胺键合固相（PSA）吸附剂、碳18（C18E）吸附剂、石墨化炭黑（GCB）吸附剂均购自美国Supelco公司;丙酮、乙腈、乙酸乙酯、甲醇为色谱纯;无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠为分析纯.
试验所用烟草及烟草制品均为福建中烟基地库存烟叶及卷烟制品.
1、2 试样浸提液制备
浸润：称取约2 g（精确至0.0001 g）样品于50 mL离心管,精确移入40 μL内标工作液后加入10 mL水,静置10 min使样品充分浸润.
萃取：加入10 mL丙酮后,2000 r/min漩涡混合振荡2 min.
盐析：依次加入4 g无水硫酸镁,1 g氯化钠,1 g柠檬酸钠,0.5 g柠檬酸氢二钠后,2000 r/min漩涡混合振荡2 min,4000 r/min离心5 min,留取上清液.
净化：移取1.5 mL上层清液于2 mL离心管中,依次加入150 mg无水硫酸镁、50 mg石墨化炭黑（GCB）吸附剂,2000 r/min 转速下漩涡混合振荡2 min,4000 r/min转速下离心5 min,留取上清液.
过滤：移取250 μL上清液于色谱瓶,加入750 ?L丙酮,经0.22 ?m有机相滤膜过滤后即为样品浸提液,待测.
1、3 标准曲线制备
内标工作液（A液）：准确称取0.01 g磷酸三苯酯标准品（精确至0.0001 g）用丙酮稀释定容至10 mL,即得浓度为1 g/L的内标储备液.准确移取1 mL内标储备液用丙酮稀释至100 mL,即得浓度为10 mg/L的内标工作液,避光贮存于0～4 ℃条件下待用.
标准储备液（B液）：准确称取0.01 g噁霉灵标准品（精确至0.0001 g）用丙酮稀释定容至10 mL,即得浓度为1 g/L噁霉灵母液.准确移取0.2 mL該母液用丙酮稀释至100 mL,即得浓度为2 mg/L噁霉灵工作储备液,避光贮存于0 ～4 ℃条件下待用.
标准工作溶液（C液）：分别移取1000、500、200、100、50 μL噁霉灵工作储备液（2 mg/L）和40 μL内标工作液（10 mg/L）到5个10 mL容量瓶中,用丙酮定容,即得噁霉灵浓度分别为0.20、0.10、0.04、0.02、0.01 mg/L,TPP内标浓度为0.04 μg/mL的标准工作溶液,即配即用.
基质匹配标准工作溶液（D液）：以不含噁霉灵的烟叶样品按照1.2的步骤制备空白样品浸提液. 分别移取250 μL各浓度标准工作溶液与250 μL空白样品浸提液混合,并用丙酮定容至1 mL,即得到浓度分别为0.05、0.025、0.01、0.005、0.0025 mg/L,TPP内标浓度为0.01 mg/L的基质匹配标准工作溶液,现配现用.
1、4 仪器条件
1.4.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX 300SB-C8（2.1 mm×100 mm,1.8 μm）;流动相：A,甲醇;B,水;梯度洗脱程序：0～4 min A∶B等于3∶7,4～10 min A∶B等于9∶1,10～15 min A∶B等于3∶7;进样量5 μL;流速250 μL/min;柱温30 ℃.
1.4.2 质谱条件 离子源：电喷雾（ESI）;电喷雾电压：5200V;离子源温度：360 ℃;气帘气：氮气0.15 MPa;雾化气：氮气0.50 MPa;碰撞气：氮气0.03 MPa;检测方式：多反应监测（MRM）;扫描模式：正离子;ESI-MS参数如表1所示.
2.结果与讨论
2、1 仪器参数的优化
2.1.1 质谱条件的优化 多级反应监控（multiple reaction monitoring, MRM）技术是在单反应监测（single reaction monitoring, SRM）技术的基础上演化而来的,该技术通过选定特征母离子碰撞诱导（collision induced）,去除其他子离子的干扰,只对选定的特征子离子进行采集,极大地消除烟草样品基质的干扰,提高噁霉灵的检测灵敏度.在这一监测模式下,噁霉灵标准溶液的质谱离子图如图1所示,其中质荷比（m/Z）100.2为噁霉灵的母离子,碰撞后会形成质荷比（m/Z）82.0、56.1、41.8等主要的子离子,其中质荷比（m/Z）41.8的响应最强,且干扰不大,可以作为定量离子,质荷比（m/Z）56.1的响应次之,且干扰不大,作为定性离子.
2.1.2 色谱条件的优化 噁霉灵极性大,比较了反相非极性色谱柱C8、C18的分离效果,结果发现,噁霉灵在C8柱上的保留时间更适合于分析,这可能是因为C8比C18碳链短,更适合极性稍强的一类物质.因质谱部分采用MRM模式检测,对色谱分离的要求较低,试验发现,采用1.8 μm粒径填料或相似填料的柱子均可满足噁霉灵的检测需要.噁霉灵具有一定的热不稳定性,柱温不宜太高,故采用30 ℃.对甲醇、水、乙腈及其组合流动相进行比较,结果发现,采用体积比3∶7的甲醇-水混合流动相,色谱峰尖锐,分离效果最好.在上述仪器条件下,实际样品萃取液的多反应监测（MRM）色谱图如图2所示.
2、2 样品前处理方法的优化
2.2.1 萃取剂的选择 对甲醇、丙酮、乙腈和乙酸
乙酯等不同极性的提取剂进行考察,结果发现（图3）：采用乙酸乙酯时回收率低于75%,乙腈和甲醇虽然回收率较高,但同时提取出的色素等大分子较多,影响检测,因此最终选用回收率较高且基质较为干净的丙酮作提取剂.
烟草粉末含水率低,不易与丙酮充分混合,用水浸润有利于噁霉灵的提取[17-18].考察了6、8、10、12、15 mL水对2 g的烟末浸润效果和对检测的影响情况,结果发现,当水的体积大于8 mL后能较好地浸润2 g烟末,大于12 mL后会影响盐析,因此最终采用10 mL水对烟末进行浸润.
2.2.2 缓冲盐体系的选择 在QuEChERS前处理方法中,常用的盐析试剂有：A,4 g MgSO4+1 g NaCl（无缓冲盐体系）;B,4 g MgSO4+1 g NaCl+1 g Na3Cit·2H2O + 0.5 g Na2HCit·1.5H2O（柠檬酸缓冲盐体系）;C,4 g MgSO4 + 1 g NaOAc（醋酸缓冲盐体系,提取溶剂中要加入1%体积的醋酸）.比较了无缓冲盐、柠檬酸缓冲盐、醋酸缓冲盐3种体系,结果发现,采用醋酸缓冲盐体系回收率最低,采用无缓冲盐体系回收率稳定性差,采用柠檬酸缓冲盐体系回收率最高.推测可能与pH值对噁霉灵的萃取影响有关：噁霉灵不溶于酸性溶液,易溶于碱性溶液;醋酸缓冲盐析体系呈弱酸性,不利于噁霉灵的溶解;无缓冲盐析体系,不加缓冲盐,pH值容易受样品基质差异影响,并最终对样品回收稳定性造成影响;柠檬酸缓冲盐析体系呈弱碱性,且缓冲体系较为稳定,受样品基质影响较小.因此,本文最终选用了柠檬酸盐缓冲体系[19-20].
2.2.3 净化吸附剂的选择 对N-丙基乙二胺键合固相（PSA）、碳18（C18E）、石墨化炭黑（GCB）三种吸附剂进行考察,结果如图4所示：N-丙基乙二胺键合固相（PSA）吸附剂的净化效果较好,但回收率较低;碳18（C18E）吸附剂和石墨化炭黑（GCB）的回收率均高于90%,且石墨化炭黑（GCB）的净化效果较好.这可能是因为N-丙基乙二胺键合固相（PSA）吸附剂同时具有弱阴离子的交换作用与极性吸附作用,在除去提取液中的碳水化合物、脂肪酸、有机酸、酚类和少量色素的同时也大量吸附了极性较强的噁霉灵;石墨化炭黑（GCB）與碳18（C18E）吸附剂的基体相似,但石墨化炭黑（GCB）对烟叶色素的吸附作用较好,碳18（C18E）吸附剂则对脂肪和酚类化合物的吸附作用较好[21-22].因此,最终选择石墨化炭黑（GCB）作为净化剂.
2.2.4 基质效应的减小 配置基质匹配标准溶液（matrix matched standard solution）是减少基质效应一种有效的途径.
采用基质匹配标准溶液（D液）的峰面积与标准溶液（C液）峰面积的比值R来表征基质效应,当该比值大于1时说明样品基质对噁霉灵的检测存在正效应,当该比值小于1时说明样品基质对噁霉灵的检测存在负效应,考察0.005、0.01、0.05 mg/L 3个水平下的基质效应,如表2所示.
由表2可知,R值在0.939～0.965之间,说明采用高效液相色谱-串联质谱测定烟草中的噁霉灵时存在一定的基质负效应;但不同产地、类型、部位、品种之间R值差异不大,因此本文采用同一基质匹配标准工作曲线来减小基质效应.
2、3 方法的验证
2.3.1 线性关系 以噁霉灵的浓度（x）为横坐标,丰度比（目标化合物峰面积与内标峰面积的比值,y）为纵坐标,如图5所示,噁霉灵在0.0025～0.050 mg/L的浓度范围与丰度比线性关系良好.取0.0025 mg/L基质匹配标准工作溶液重复10次进样,分别按3倍、10倍偏差计算检出限,检测限浓度分别为0.32 μg/L、1.06 μg/L.
2.3.2 回收率与重复性试验 在同一样品中,添加0.2、0.5、1.0 mg/kg 三个水平的标样和40 μL内标工作液,按1.3、1.4所述进行样品前处理和检测,结果如表3所示,回收率在90.8%～92.0%之间,平 均回收率为91.5%.3个水平的RSD分别为5.6%、5.0%和4.8%,平均5.1%,重复性较好.
2.3.3 样品的测定 按上述方法对部分样品进行检测,如表4所示,其中1～10#为田间样品,11～20#为库存样品,21～30#为卷烟制品.由结果可以看出,田间样品检出率较高,含量在0.026～0.215 mg/kg之间;库存样品仅少数样品检出噁霉灵,含量远小于0.50 mg/kg的限量值;卷烟样品则均未检出.
3.结 论
通过试验,建立了以QuEChERS为样品前处理方法、液相色谱串联质谱仪为检测仪器的烟草中噁霉灵残留量的检测方法.结果发现,该方法线性良好,r2等于0.9996,回收率均在90.8%～92.0%之间,相对标准偏差为5.1%,满足CORESTA对烟草农残检测的要求.采用三重四级杆质谱作为液相检测器,规避了电化学分析法检测灵敏度低、选择性差,气相色谱法稳定性差、需衍生化等问题,解决了采用紫外吸收作检测器时基质干扰严重、灵敏度低的弊端,且操作简单、效率高,适合推广运用.
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总结：上文结论：该文是关于高效方面的大学硕士和本科毕业论文范文,可作为高效液相色谱和烟草相关论文开题报告写作参考和职称论文写作文献资料.
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