当前位置:论文写作 > 职称论文 > 文章内容

五种糖类对犬冷冻保存效果

主题:糖类 下载地址:论文doc下载 原创作者:原创作者未知 评分:9.0分 更新时间: 2023-12-25

简介:该文是狗方面论文如何写跟糖类有关论文如何写.

狗论文范文

摘 要:选取8只身体健康、性欲旺盛的比格公犬,采集其,对鲜精进行质量检测,主要包括颜色、量、精子活率、活力和pH.选取精子活率达到70%以上犬用于后续冷冻试验.分别将含有葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和海藻糖的稀释液与按照1∶2的比例进行稀释.经冷冻解冻后,进行活率、活力、质膜完整性和顶体完整性的精子质量检测.通过对新鲜进行品质检测,结果显示5只合格用犬的平均量为2.85 mL,密度为2.01×108个/mL,pH为6.56.含有果糖的冷冻稀释液中精子活率和活力最高,分别达59.90%和54.00%;其次是添加葡萄糖和乳糖的稀释液中活率较高,分别为59.21%和56.73%,且两组稀释液中精子解冻后活力均为52.00%.进一步评估精子解冻后质膜完整率,结果显示葡萄糖和果糖组显著高于其他组,分别达48.73%和49.52%;而蔗糖添加组精子质膜完整率最低,为42.21%.稀释液中添加果糖的精子解冻后顶体完整率显著高于其他组,而添加蔗糖组顶体完整率最低.在比格犬的冷冻保存中,添加果糖的冷冻稀释液能显著提高精子的活率和活力,从而达到提高冻精质量的效果.

关键词:犬;冷冻;冷冻保护剂;糖类

中图分类号:S814.3;S829.2文献标识码:A文章编号:1007-273X(2020)06-0010-03

人工授精是一项发挥优秀公畜遗传潜力的重要现代动物生物技术,而冷冻是实现人工授精的重要技术环节[1].目前,牛和羊等动物的冷冻已经商业化生产,广泛用于人工授精和体外受精,进行优良品种的繁殖.然而,犬的冷冻保存效果较差,冻精解冻后精子活力低,用于人工授精后导致受胎率低、产仔数少等问题.犬的冷冻技术研究开始于1967年,美国对犬冷冻做了大量研究,并制定了冷冻生产及操作规程,然而因精子质量问题未得到广泛推广.有研究使用犬冷冻进行人工授精,其受胎率虽低于自然交配,但胎儿死亡率、先天性畸形率、初生重及性比例均与自然交配相似[2].目前,在发达国家,犬的冷冻保存研究已经广泛开展.我国对犬冷冻技术和人工授精技术研究始于20世纪80年代,目前尚处于试验研究阶段,生产实践中并没有普及和推广.潘寿文等[3]报到了德国牧羊犬冷冻的研究,冻精人工授精成功.禹学礼等[4]对豫西土犬的冷冻和人工授精试验获得成功,受胎率达到57%,平均窝产仔3只.此后,李彩霞[5]、曹授俊等[6]、王素梅等[7]分别做了相关的研究,但冻精质量差、受胎率低一直是制约我国犬冷冻技术发展的重要因素.

在冷冻保存过程中,稀释液中糖类物质不仅能为精子生存以及运动提供能量,也能提高精子冻后的活率以及顶体完整性.因此,本试验旨在探寻葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和海藻糖在比格犬冷冻中的添加,并研究其对冻精质量的影响,为犬冷冻产业化生产提供参考,促进犬冷冻技术更加成熟.

1 材料与方法

1.1 试验动物

随机选取上海交通大学农业与生物学院身体健康、发育正常的雄性比格犬8只,年龄2~5岁.犬只单独饲养在围栏里,每天定时定量由固定饲养员饲喂全价种公,并提供新鲜饮用水,采集前1 h禁食.

1.2 仪器与试剂

犬用集精杯、温度计、电子分析天平、消毒锅、离心机、磁力搅拌器、恒温水浴锅、光学显微镜、冰箱、0.5 mL冻精细管、液氮罐、一次性精子计数板(迈朗)、精子分析仪(迈朗,SJ-TMDI608)、便携式pH检测仪.

三羟甲氨基甲烷(Tris)、甘油、新鲜蛋黄、青霉素、链霉素、双蒸水、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和海藻糖等均由上海市农业科学院提供.

1.3 方法

1.3.1 处理

(1)采集.通过对试验用犬为期2周的采精调教后,采用手握法收集.

(2)鲜精处理.采集后,立即记录量、pH、颜色和气味,之后进行品质分析,合格的进行下一步处理.只有量≥0.6 mL、精子密度≥2×108个/mL、精子活率≥70%的被用于后续试验[8].为排除个体差异,将合格的进行混合后,按照要求进行分组稀释.

(3)稀释液配方.根据以往文献,在以Tris为基础的传统稀释液中,分别添加葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和海藻糖作为冷冻保护剂,配方列于表1[8-10].之后检测解冻后精子活率、活力、质膜完整率和顶体完整率.

(4)的稀释与分装.将经检测合格的,在37 ℃下500 r/min離心10 min去除上层精清,将用5种稀释液按照1∶1的比例进行稀释,至最终度为200×106个/mL.将包裹8层纱布放置在4 ℃冰箱内降温平衡2 h,分装至0.5 mL冻精细管中,并做好标记.

(5)的冷冻与解冻.将冻精细管放置距离液氮上方4 cm处,利用液氮熏蒸法熏蒸15 min,之后投入-196 ℃的液氮中储存,直到评估.解冻时,将冻精细管快速从液氮中拿出,放入37 ℃的水浴中,来回摆动,30 s即可解冻.将细管中收集至1 mL离心管中,37 ℃孵育30 min,随后进行品质检测.

1.3.2 的品质检测

(1)精子密度和pH.采用血细胞计数板进行测定.采用pH检测仪进行的pH检测.

(2)精子活率和活力测定.取解冻后样品15 μL滴加在37 ℃预热的一次性精子计数板上,在200×光学显微镜下随机选择4个视野,利用精子分析仪,自动识别运动精子、直线运动精子和死亡精子数量,经计算后形成活率和活力数据.其中,精子活率等于运动精子数/总精子数×100%,精子活力等于直线运动精子数/总精子数×100%.

(3)精子质膜完整率测定.采用低渗肿胀法(HOST)检测精子质膜完整性.将9.0 g果糖和4.9 g柠檬酸钠溶于1 000 mL蒸馏水中配置成HOST低渗溶液.将10 μL加入100 μL 37 ℃预热的HOST低渗溶液中,37 ℃孵育40 min,取10 μL涂于载玻片上,晾干后在200×光学显微镜下随机观察4个视野,统计质膜完整和不完整的精子.其中,精子尾部有卷曲或精子膨胀为质膜完整精子;反之,则为质膜不完整精子.精子质膜完整率等于膜完整精子数/总精子数×100%.

(4)精子顶体完整率测定.采用考马斯亮蓝法测定.将解冻后的100 μL加入500 μL 37 ℃预热生理盐水中,1 000 r/min 离心15 s后弃上清.加入500 μL多聚甲醛,室温固定20 min,再次离心弃上清.通过PBS悬浮洗涤2次后,取10 μL样品进行涂片,经空气干燥后,滴加0.22%考馬斯亮蓝染液,室温静置10 min.将染液洗涤干燥后,于油镜下观察顶体完整情况.每张抹片中观察200个精子,并统计顶体完整的精子数.其中,顶体着色为均匀的蓝色,代表顶体完整;反之,顶体着色浅或未染色,且边缘不完整为顶体缺失或损坏.精子顶体完整率等于顶体完整的精子数/总精子数×100%.

1.4 统计分析

上述试验均重复3次,所得数据采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析,所有数据以平均值±标准误表示,当P<0.05表示差异显著.

2 结果与分析

2.1 比格犬鲜精品质检测结果

本试验共采集8只公犬的,进行品质检测分析(表2).其中1号、3号和6号的犬只检测结果不符合后续试验要求.故选用2号、4号、5号、7号和8号犬为试验犬,采集后进行冷冻与冻后分析.通过对合格的5只犬新鲜进行品质检测,犬平均量为2.85 mL,密度为2.01×108个/mL,pH为6.56.

2.2 不同糖类对犬精子冷冻保存效果的影响

稀释液中不同糖类物质对犬精子解冻后的精子活率、活力、质膜完整性和顶体完整性影响如表3所示.其中添加葡萄糖和果糖的稀释液中精子解冻后活率最高,分别为59.21%±2.00%和59.90%±1.36%(P<0.05);添加蔗糖和海藻糖精子解冻后活率较低,分别为49.52%±2.20%和49.52%±1.74%.通过检测解冻后精子活力发现,仅添加蔗糖稀释液的精子活力最低,为0.46%±0.01%,而稀释液中添加其余4种糖类物质的精子解冻后活力差异不显著(P>0.05).进一步评估精子解冻后质膜完整率,结果显示添加果糖的稀释液组质膜完整率最高,为49.52%±2.12%,且与添加葡萄糖、乳糖和海藻糖差异不显著(P>0.05),但添加蔗糖的精子质膜完整率最低,为42.21%±2.68%(P<0.05).通过对各组冻后精子顶体完整率检测发现,添加果糖组最高,为48.20%±1.80%,而添加蔗糖组最低,为40.59%±2.38%.

3 讨论

冷冻稀释液中糖类物质作为非渗透性保护剂,在冷冻过程中能提高细胞外的渗透压,从而避免细胞内水分向外流出而造成细胞脱水而皱缩,也能进一步减少细胞内冰晶形成,从而避免细胞遭受破坏[11].此外,以往研究显示稀释液中糖类物质的添加能减少甘油对精子的毒害作用,从而提高精子活率和顶体完整率[12].

作为反映精子运动状态的重要指标,精子活率直接影响精子的受精能力,从而影响受精率.目前,不同国家对于解冻后精子活率和活力的标准不同,发达国家普遍要求均为35%以上,我国对解冻后的精子活率和活力要求均为30%以上[13].稀释液中添加的5种糖类物质后,犬解冻后精子活率和活力均超过国内外标准,说明5种糖类物质的稀释液均能保证犬精子解冻后的受精能力.其中,添加果糖的稀释液中犬精子冻后活率最高,葡萄糖次之.较多研究已经证明果糖和葡萄糖是精子的主要能量来源,但在犬的中没有发现果糖和葡萄糖的存在.因此,外源性的添加果糖和葡萄糖能增加犬解冻后精子的能量代谢[13].

精子质膜是在精子冷冻和解冻过程中最易受损伤的部位,也是影响精子受精能力的重要因素之一.精子质膜的完整性对精子维持自身新陈代谢、精子获能和顶替反应等能力有直接关系[15].本试验结果表明,稀释液中添加不同糖类物质对犬精子冻后的质膜完整率效果依次为果糖>葡萄糖>海藻糖>乳糖>蔗糖.稀释液中添加糖类物质主要有两方面作用,第一,糖类物质能提高过氧化物酶的活性,防止细胞质膜受到脂质过氧化,从而保持细胞膜通透性的稳定;第二,糖类物质具有一定黏性,能黏附在精子,形成一个微环境,减少冷冻过程中形成的冰晶,从而防止冰晶对细胞质膜完整性的破坏[15].此外,有研究显示,蔗糖在哺乳动物低温保存中,必须和渗透性抗冻剂联合使用才能有效保护精子,这也进一步解释了本试验中稀释液添加蔗糖组精子解冻后质膜完整性最低的原因[16].

精子顶体中含有能影响精子受精能力的水解酶,若顶体结构受损伤而破坏,造成水解酶的丢失,直接影响精子的受精能力.保持精子完整性也是精子能够完成顶体反应、穿过透明带的必要前提[17].目前,已经证明精子受到低温应激后,会出现顶体异常,造成顶体完整率降低,一定程度上影响了精子的冷冻保存效果[18].本试验研究结果表明,稀释液中添加不同糖类物质对犬精子冻后的质膜完整率效果依次为果糖>乳糖>葡萄糖>海藻糖>蔗糖.以往研究显示,稀释液中添加糖类物质,通过激光扫描共聚焦显微镜检测发现其能增加细胞膜流动性,从而令精子顶体完整率得到提升[19].本研究结果显示,添加果糖组的精子冻后顶体完整率显著高于蔗糖组,进一步说明果糖作为犬稀释液相对于蔗糖更加具有优势.

综上所述,不同糖类物质对犬精子的冷冻保存具有不同程度的影响,综合解冻后犬精子的活率、活力、质膜完整性和顶体完整性检测结果,果糖作为犬的冷冻稀释液是最佳的.

参考文献:

[1] SALMON V M,LECLERC P,BAILEY J L. Novel technical strategies to optimize cryopreservation of goat semen using cholesterol-loaded cyclodextrin[J].Cryobiology,2017,74:19-24.

[2] 郝志明,雷 磊.发情前期和发情期格力犬的血清孕酮水平及其适配期的冻精人工授精[J].中国兽医杂志,2018,54(3):30-32.

[3] 潘寿文,刘 湖,马大君,等.犬的冷冻技术[J].畜牧与兽医,1986(3):25-30.

[4] 禹学礼,栗颖华.犬颗粒冻精人工授精的试验[J].黑龙江动物繁殖,1997(1):10-11.

[5] 李彩霞.犬保存稀释液和温度的筛选及冻精品质评定的研究[D].兰州:甘肃农业大学,2004.

[6] 曹授俊,雷莉辉,胡 平,等.犬冷冻保存条件的优化[J].黑龙江畜牧兽医,2012(5):148-150.

[7] 王素梅,孙耀辉,秦光彪,等.犬冷冻稀释液配方优化试验[J].特种经济动植物,2015(4):10-12.

[8] 沈留红,杨庆稳,曹随忠.犬冷冻液的优化试验[J].中国兽医杂志,2012(48):27-29.

[9] CATURLA-SáNCHEZ E,SáNCHEZ-CALABUIG M J,PéREZ-GUTIéRREZ J F,et al. Vitrification of dog spermatozoa:Effects of two cryoprotectants(sucrose or trehalose) and two warming procedures[J].Cryobiology,2018,80:126-129.

[10] YAMASHIRO H,NARITA K,SUGIMURA S,et al. Trehalose enhanced the freezability of Poodle dog sperm collected by an artificial vagina()[J].Animal reproduction science,2007, 102(1-2):165-171.

[11] 南向斌.三种多糖和冷冻平衡时间对牛冷冻效果影响的研究[D].陜西杨凌:西北农林科技大学,2010.

[12] 张树山,李青旺,李 刚,等.海藻糖、蔗糖和乳糖对猪冷冻保护效果的影响[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2006(6):41-45,51.

[13] Ponglowhapan S,Birgitta Essén-Gustsson,Forsberg C L. Influence of glucose and fructose in the extender during long-term storage of chilled canine semen[J].Theriogenology,2004, 62(8):165-171.

[14] 牟珍妮,孙振高,刘红根,等.精子获能通路的最新研究进展[J].中国优生与遗传杂志,2018,26(8):1-4.

[15] 何 涛.三种多糖对猪精子冷冻保存效果的研究[D].陕西杨凌:西北农林科技大学,2010.

[16] 张 婷.四种糖类对猪冷冻保存效果的研究[D].陕西杨凌:西北农林科技大学,2008.

[17] PENZIAS A S. The Physiology of Reproduction,vols 1 & 2[J]. The journal of the american medical association,1994,272(19):1552.

[18] 禹学礼.豫西土犬冷冻与人工授精的研究[D].陕西杨凌:西北农林科技大学,2003.

[19] 谢东淇.茶多酚和壳聚糖对猪常温保存效果的研究[D].陕西杨凌:西北农林科技大学,2016.

收稿日期:2020-04-20

基金项目:上海市农口系统青年人才成长计划[沪农青字(20l8)第l-22号]

作者简介:孙玲伟(1987-),女,黑龙江伊春人,助理研究员,博士,主要从事动物繁殖学研究,(电话)17740813839(电子信箱)

sunlingwei1987@126.com;通信作者,张德福(1963-),男,上海奉贤人,研究员,博士,主要从事动物繁殖生物技术研究,

(电话)021-52235475(电子信箱)zhangdefuzdf@163.com.

总结:简而言之,这篇文章为一篇关于对写作糖类论文范文与课题研究的大学硕士、狗本科毕业论文狗论文开题报告范文和相关文献综述及职称论文参考文献资料有帮助.

糖类引用文献:

[1] 多尔林和他的细狗论文范文 多尔林和他的细狗类有关学术论文怎么写2000字
[2] 一只狗论文范文 关于一只狗硕士毕业论文范文2000字
[3] 狗和宠物论文怎么写 狗和宠物类有关论文范文文献8000字
《五种糖类对犬冷冻保存效果》word下载【免费】
糖类相关论文范文资料
热门狗相关频道