简介:该文是关于组织培养和荞麦方面硕士学位论文范文与荞麦相关自考毕业论文范文.
摘 要：目的：荞麦叶大百合长期处于野生状态,不适宜连续分球、扦插等繁殖方式.采用组织培养进行繁殖,探究启动培养、诱导愈伤组织及不定芽的最佳培养基,以期建立荞麦叶大百合快速繁殖体系.方法：所有实验采用MS基本培养基.在外植体灭菌实验中,采用75%乙醇与0.1%升汞灭菌,对比污染率与诱导率筛选最适消毒方式;鳞片启动培养实验中,附加不同浓度的6-BA与NAA,计算并对比诱导出愈伤组织或不定芽的诱导率;诱导愈伤组织实验中,采取不同浓度的2,4-D与相同浓度的6-BA（0.5mg/L）和NAA（0.1mg/L）进行配比来诱导愈伤组织,并比较诱导率;在诱导不定芽分化的实验中,不同浓度的6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0mg/L）与NAA（0.1mg/L）诱导愈伤组织分化不定芽.结果：以75%乙醇50s,0.1%升汞8min,对鳞片的灭菌作用最好;MS+1.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA最适于鳞片的启动培养,诱导率高达90.67%;MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+2.0mg/L 2,4-D的培养基对叶片愈伤组织的诱导效果最佳,诱导率为49.43%;MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA时,愈伤组织分化的不定芽数量最多,诱导率达到78.81%.
关键词：荞麦叶大百合;组织培养;鳞片
中图分类号：Q943.1 文献标识码：A 文章编号：1673-260X（2020）09-0022-05
引言
荞麦叶大百合（Cardiocrinum cathayanum）,多年生粗壮草本植物,属百合科大百合属,多处于野生状态,为中国特有[1,2],在我国江苏、浙江、安徽、江西、湖南、湖北等地均有分布,生长在海拔600～1050m的山坡、谷地疏林和灌木丛中,是华中华东分布的特有种[3,4].大百合属植株高大,姿态挺拔优美,春季萌发基生叶莲座状,叶片碧绿油亮,夏季总状花序顶生,花大洁白而美,可做切花、盆花和花境植物等,具有较高的观赏价值[5].大百合属基生叶的叶柄基部膨大形成鳞茎,富含多种营养物质,鳞茎研磨后可取食,具有保健和营养价值[6].百合属植物具有药用功能,果实入药[7],已研制出具有清肺止咳、解毒、散瘀功效的药用百合七,作为一味中药广泛运用[8].
百合科植物通常通过扦插、分球或分株进行繁殖,荞麦叶大百合为野生,繁殖多采用种子繁殖和分球繁殖,种子发芽率极低,而分球繁殖具有繁殖率低,不能满足规模化生产的需要,而且这些繁殖方式容易造成百合品质和优良性状的退化,使荞麦叶大百合的价值降低,在一定程度上影响野生花卉荞麦叶大百合的推广和应用[9,10].
解决荞麦叶大百合繁殖问题较为行之有效的方法是进行组织培养,组织培养能在短期内大量快速繁殖,是有效的商业化、产业化生产的途径.本实验对荞麦叶大百合的组织培养进行初步研究.而鳞茎一般作为百合科植物组织培养的外植体[11,12],本实验同样采用鳞茎作为启动培养的外植体,但由于鳞茎长期生长于地下,具有大量的真菌和细菌,很难做到完全消毒灭菌,总体上污染率偏高.本实验通过75%乙醇与0.1%升汞的处理,筛选污染率较小的消毒方法为后续实验做准备.
采用组织培养的方法繁殖大百合,可以加快繁殖速度,荞麦叶大百合虽一直处于野生状态,但目前对其离体培养已有了一定的研究,并且得到了一些较理想的方法[11-13].以往在百合科植物进行组织培养的研究中,肖玉菲[13]等人在进行大百合鳞茎诱导出芽的实验中,采用不同浓度梯度的6-BA和NAA处理大百合鳞茎,观察接种后是否产生愈伤组织,或产生不定芽.结果表明,MS+5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA更有利于誘导鳞茎产生愈伤组织,作为启动培养基;马生军[13]等人以不同浓度的6-BA和NAA进行配比诱导不定芽分化,其中MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA为最佳诱导不定芽培养基.
本实验首先以鳞茎为外植体,以MS为基本培养基,附加不同浓度6-BA与NAA,通过对比诱导率筛选最适启动培养基;在诱导愈伤组织的实验中,在MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA培养基的基础上附加不同浓度的2,4-D,对比愈伤组织的状态与诱导率选出最适愈伤组织诱导培养基;成功诱导愈伤组织后,不同浓度的6-BA与0.1mg/L NAA配比,附加于MS基本培养基中诱导不定芽的分化,并将在培养过程中生根的组培苗移栽至温室中,以期达到后续可持续利用的目的.同时,为荞麦叶大百合的人工培养和大量繁殖提供理论依据,更好地开发利用荞麦叶大百合资源.
1 实验材料与方法
1.1 实验材料
荞麦叶大百合的外植体为鳞茎,取自安徽省黄山风景区温泉附近的荞麦叶大百合野生群落,取回后立刻对其进行假植.
1.2 培养基及培养环境
1.2.1 培养基
实验以MS为基本培养基,不同的培养阶段设置不同激素浓度组合.
1.2.2 培养环境
培养室温度为25±2℃,空气相对湿度为70%,日光灯光源,光照强1000lx,光照12h/d.
1.3 实验方法
1.3.1 外植体的预处理
取生长健壮、无病虫害的荞麦叶大百合鳞茎作为外植体,清洗表面泥污,小心剥离鳞茎,将中层内层的鳞片在洗衣粉溶液中浸泡5min,再用自来水流水冲洗2h.
1.3.2 接种方法
接种前将鳞片切成0.5cm×1cm的小块,用无菌水冲洗掉流出的组织液,在5mg/ml的抗坏血酸（Vc）溶液中浸泡5min备用.将小鳞片腹面向上接种到培养基上.每瓶培养基接种1个,每个处理30瓶,3次重复.
1.4 实验设计
1.4.1 不同消毒方式对鳞片启动培养的影响
采用75%的乙醇、0.1%的升汞和吐温-80对鳞片进行4个时间梯度处理,不同消毒时间处理方法如表1所示.将鳞片接种在MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NA蔗糖30g+琼脂6.4g的培养基中,培养20天后统计污染率和诱导率.
1.4.2 不同激素配比对鳞片启动培养的影响
采用最佳的消毒方式处理鳞片后,分别接种到不同的诱导培养基中,具体激素配比如表2所示,培养30天后统计诱导率.
1.4.3 不同激素配比对愈伤组织诱导的影响
以鳞片启动培养诱导出的健壮、无褐化现象的叶片为材料,分别接种到相应的愈伤组织诱导培养基中,激素配比如表3所示,培养30天后统计结果.
1.4.4 不同激素配比对不定芽诱导的影响
选择生长状况良好、嫩绿且结构紧密的愈伤组织为接种材料,切成0.5cm×0.5cm的小块,分别转接到不同处理的培养基上,培养30天后统计分化情况.
1.4.5 组培苗移栽
在上述实验过程中会诱导出根,将生根且生长良好的组培苗移栽至温室的基质中,移栽前喷洒一定浓度的多菌灵进行基质杀菌消毒,并在移栽后定期喷洒营养液.
1.5 数据统计与分析
接种后每隔10d进行一次观察,记录产生愈伤组织及不定芽的数量,以及组培苗生长状况.
数据统计使用Excel 2010进行,数据处理使用SPSS 20.0软件的ANOVA過程对各处理进行差异性的检验和Duncan法对结果进行多重比较.
2 结果与分析
2.1 不同消毒方式对启动培养的影响
在组织培养的过程中,出现污染的情况是很常见的,污染率的高低是植物组织培养成功的关键.本实验通过用75%乙醇与0.1%升汞处理外植体的时间长短不同,来探究消毒时间对污染率与诱导率的影响.
由表1可以看出,每种消毒方法都对污染率产生一定遏制作用,随着消毒时间的延长,污染率逐渐降低.A组处理（75%乙醇30s,0.1%升汞6min）下的外植体污染率最高,达到83.64%,显著高于其他三组处理,且A组处理最先出现污染情况;同时A组处理下的诱导率最低,为24.33%,明显低于其他三组处理下的诱导率,显然A组消毒处理不适宜荞麦叶大百合启动培养.同样,B组处理（75%乙醇40s,0.1%升汞7min）下外植体污染率为57.65%,诱导率为34.25%,二者均次于C、D两组处理.
D组处理（75%乙醇60s,0.1%升汞9min）污染率最小,为42.35%,并且明显低于另三组处理,但该处理下的诱导率为46.28%,显著低于C组处理75%乙醇50s,0.1%升汞8min下的诱导率52.67%.猜测可能是由于升汞处理的时间过长,使鳞片的诱导率降低.
上述分析表明,本实验中C组消毒处理的效果最好,后续接种实验均采用该消毒方法.
2.2 鳞片启动培养的诱导
本实验以MS为基本培养基,附加不同浓度6-BA和NAA配制培养基接种荞麦叶大百合鳞片,进行初代启动培养,通过对比诱导率筛选最适启动培养基,结果见表2.接种后的鳞片在培养的第四天,鳞片体积显著增大,颜色逐渐变绿,部分鳞片出现红紫色的条纹.有些鳞片经诱导后直接形成的绿色的大型叶片,叶片在培养的过程中可形成愈伤组织,甚至可以分化出淡绿色的不定芽.
从表2可以看出,当6-BA浓度为0.5mg/L时,诱导率随着NAA的浓度增加而降低,且四组激素配比处理下的诱导率均较低.其中,5组处理（MS+1.5mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA）下的诱导率最高,为60.00%,相同浓度的6-BA处理下,当NAA为0.1mg/L时诱导率明显高于0.5mg/L的处理结果.可得出结论：NAA在低浓度（0.1mg/L）条件下对荞麦叶大百合鳞片启动培养效果最佳.
当NAA浓度为0.1mg/L时,随着6-BA浓度的增加,诱导率逐渐增高,除1组处理（MS+0.1mg/L NAA）诱导率较低为51.62%外,其他三组处理诱导率均较高.其中,4组处理（MS+1.5mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA）下,诱导率最高为90.67%,且显著高于其他激素配比处理,相对于1组处理诱导率提高了39.05%,而在本次实验所有处理组中,明显高于8组处理,其诱导率为42.33%,提高了48.34%;同时,诱导率仅次于4组处理的3组处理,其诱导率为75.33%,相对于4组处理,显著降低了15.34%.
实验表明细胞分裂素6-BA对鳞片的启动培养有促进作用,而高浓度的生长素NAA对鳞茎的诱导有抑制作用.由上述分析得出,本实验中培养基中的激素配比为MS+1.5mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA时,鳞片的启动效果最好.
2.3 愈伤组织的诱导
由2.2可知,MS+1.5mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA诱导率最高.本实验将不同浓度梯度的2,4-D（0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L）和0.5mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA配制愈伤组织诱导培养基接种叶片.叶片在接种后,逐渐出现淡绿色、半透明的疏松组织,随着培养时间的延长,慢慢变为白色的、结构紧密的愈伤组织,激素配比对诱导率的影响差异见表3.
由表3可知,2,4-D对叶片愈伤组织诱导率有显著影响,且有助于提高叶片愈伤的诱导率.随着2,4-D的浓度的增加,诱导率递增.当2,4-D浓度为2.0mg/L时,诱导率最高,达到49.43%,与浓度为1.5mg/L时诱导率无明显差别,但显著高于剩余两组处理.1组处理,当2,4-D浓度为0.5时,诱导率最低,为41.67%,相对4组处理,显著降低了7.76%.
综上所述,MS+1.5mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA+2.0mg/L是用于诱导愈伤组织的最佳培养基.
2.4 不定芽的分化
愈伤组织转接到相应的诱导培养基后,其体积不断地增大,同时形成2-4个淡绿色的小突起,继而伸长形成不定芽.本实验通过不同浓度的6-BA与0.1mg/L的NAA配比处理愈伤组织诱导不定芽,探究不同激素配比对不定芽诱导率的影响,结果见表4.
由表4分析可知,6-BA对愈伤组织对不定芽的诱导有促进作用,当NAA浓度为0.1mg/L时,不定芽的诱导率随着6-BA浓度的增加而显著增加.4组处理（2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA）下不定芽的诱导率最高,达到78.81%,且显著高于另外三组处理,相对于1组处理（0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L）诱导率为29.71%,显著提高了29.1%.而2组处理（1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA）与3组处理（1.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA）下的不定芽诱导率分别为34.56%与54.55%,显著高于1组处理,但明显低于4组处理.
综上所述,4组处理（2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA）最适宜诱导愈伤组织分化不定芽.
3 结论与讨论
植物根际存在大量微生物,因而在以荞麦叶大百合鳞茎作为外植体时,接种前灭菌的方式与时间至关重要,灭菌剂浓度过大或灭菌时间过长都容易使外植体受到伤害,浓度过小或过短,灭菌不彻底,而达不到灭菌的最终效果.本研究中75%乙醇消毒50s、0.1%升汞消毒8min鳞片的启动效果好,成活率高,且污染率相对较低;而75%乙醇消毒60s、0.1%升汞消毒9min時虽然污染率低,但鳞片褐化死亡现象严重,影响到了鳞片的成活率.李国瑞[14]在紫薇灭菌时间的研究与本研究结论一致,较嫩的外植体应当适当减少灭菌时间.
在植物组织培养过程中,添加适当的外源激素是成功诱导愈伤组织的关键因素[15].在荞麦叶大百合的组织培养实验中,多数研究者采用6-BA与NAA,本实验采用2,4-D与6-BA、NAA相互配比诱导愈伤组织,且结果表明,2,4-D对荞麦叶大百合愈伤组织的诱导有明显的促进作用.
任江萍等在大麦幼胚立体培养条件的建立中也提到,不同浓度2,4-D对大麦愈伤组织的诱导存在较大差异[16].本研究中荞麦叶大百合叶片愈伤组织的诱导实验中,2,4-D能够促进叶片的出愈率.2,4-D浓度为2.0mg/L时,诱导效果最佳,与任江萍的研究相似,她认为2,4-D的浓度在1-2 mg/L时,愈伤诱导率较高[15].
植物生长发育过程与植物的内源和外源激素种类、含量及配比等有密切关系.在诱导愈伤组织产生不定芽的实验中,可以看出6-BA对不定芽的诱导有较明显的影响,在马生军[12]等人的实验中,NAA浓度不变时,随着6-BA浓度的增加呈现先增加后下降的趋势,该结果与本实验结果相同,6-BA2.0mg/L与NAA0.1mg/L配比时,分化的不定芽数量多,生长速度快.
由于荞麦叶大百合长年生长于野生状态,移栽后需要多加管理,并于后期喷洒一定量的营养液使移栽后的组培面生长良好,为其后续利用提供更多材料,以满足市场需求.
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总结：结论：本文论述了关于对不知道怎么写荞麦论文范文课题研究的大学硕士、组织培养和荞麦本科毕业论文组织培养和荞麦论文开题报告范文和文献综述及职称论文的作为参考文献资料.
荞麦引用文献:
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[2] 何首乌和组织培养自考毕业论文范文 关于何首乌和组织培养类硕士学位论文范文2万字
[3] 植物组织培养和植物论文范文集 植物组织培养和植物类有关论文范文检索2000字
