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三株芽孢杆菌的生防特性

主题:芽孢 下载地址:论文doc下载 原创作者:原创作者未知 评分:9.0分 更新时间: 2024-02-07

简介:本文是关于芽孢杆菌自考毕业论文范文与芽孢方面硕士论文范文.

芽孢杆菌论文范文

芽孢论文

目录

  1. 1.材料与方法
  2. 1、1 试验材料
  3. 1、2 试验方法
  4. 2.结 果
  5. 2、1 三株生防菌对烟草种子萌发和烟株生长的影响
  6. 2、2 三株生防菌抑菌谱
  7. 2、5 菌株产生嗜铁素和蛋白酶的能力
  8. 2、6 温度和pH对生防菌株抑菌蛋白稳定性的影响
  9. 2、7 根际定殖情况
  10. 3.讨 论
  11. 4.结 论

摘 要:为明确贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)GY1、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GY10和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GY12的生防特性,采用平板试验法、对扣法、盆栽试验等,对三株生防菌的抑菌谱、次生代谢产物、挥发性物质、根际定殖能力和促生能力等进行了研究.结果表明,GY1、GY10、GY12培养液可以显著促进烟草种子的萌发和烟株的生长;三株生防菌抑菌谱广,对烟草赤星病菌、黑胫病菌及花生镰刀菌等9种病原具有显著的抑制作用,并且都具有分泌嗜铁素和蛋白酶的能力;三株生防菌发酵上清液和挥发性物质对链格孢菌(Alternaria alternata)和烟草疫霉菌(Phytophthora parasitica var. nicotianae)具有显著抑制作用;菌株的分泌蛋白热稳定性好,对烟草赤星病菌具有显著的体外抑菌活性,并对酸性环境具有较高的耐受性;根际定殖结果表明,GY1-GY10-GY12复配与单菌株相比能增加各生防菌在烟草根际的定殖.以上结果对于菌株GY1、GY10、GY12生防特性的深入挖掘和产业化开发具有一定的指导作用.

关键词:芽孢杆菌;烟草黑胫病;烟草赤星病;生防特性;根际定殖

Abstract: In order to clarify the biocontrol characteristics of Bacillus velezensis GY1, Bacillus amyloliquefaciens GY10, and Bacillus subtilis GY12, antibacterial spectrum, secondary metabolites, volatile substances, rhizosphere colonization ability and growth-promoting ability of the strains were studied by compatible test, double petri dish assay and pot test. The results showed that GY1, GY10, and GY12 can significantly promote seed germination and growth of tobacco. The three strains he a broad antimicrobial spectrum and he significant inhibitory effects against Alternaria alternata, Phytophthora parasitica var. nicotianae and Fusarium spp. In addition, all of the tree strains he the ability to produce siderophore and protease. The fermentation supernatants and volatile substances of the three strains also he a significant inhibitory effect against A. alternata and P. parasitica var. Nicotianae. The secreted proteins of the strains he good thermal stability and significant in vitro antibacterial activity on A. alternata, and he high tolerance to acid environments. The results of rhizosphere colonization assay indicated that GY1-GY10-GY12 compounding could increase the colonization of each biocontrol bacteria in the tobacco rhizosphere compared with a single strain. The resuls from this study provide guidance for in-depth exploration of the biocontrol characteristics of strains GY1, GY10, and GY12 and the industrial development of biocontrol strains.

Keywords: Bacillus spp.; Phytophthora parasitica; Alternaria alternata; biocontrol mechani; rhizosphere colonization

生物防治是利用有益微生物或其代謝产物对植物病害进行防治的技术,因其具有绿色、安全、防效持久,不污染环境等特点在农业生产中逐渐被应用.烟草生育期内会被很多病害侵染,如由烟草疫霉菌(Phytophthora parasitica var. nicotianae)引起的烟草黑胫病及由链格孢菌(Alternaria alternata)引起的烟草赤星病[1-2].目前,生产上对该类病害的防控主要依靠化学药剂,但是长期大量施用会对环境以及人类健康造成严重危害,因此生物防治成为烟草病害防控的重要措施之一[3].生防细菌在生物防治中表现出巨大潜力,尤其是芽孢杆菌(Bacillus spp.)已被广泛应用于植物病害的防控.

芽孢杆菌在自然界分布广泛,其繁殖速度快,环境适应能力和抗逆能力强,是当前生防产品中使用最广泛的一种生防菌.目前应用于生物防治的芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)等[4].芽孢杆菌拮抗植物病害的机理有两方面:一是对病原菌的直接抑制作用,包括竞争作用、抗生作用、产生胞外酶和溶菌作用等[5];二是增强植物自身抵御病原菌入侵的能力[6],如分泌促生物质、激发诱导抗性等.关于利用芽孢杆菌防治植物病害的研究有很多报道,张铎等[7]发现枯草芽孢杆菌BSD-2有较宽的抑菌谱,对棉花黄萎病等10种植物病菌有显著抑制作用.解淀粉芽孢杆菌CPA-8产生的挥发物质能够抑制核果褐腐菌(Monilinia laxa)和灰葡萄孢(Botrytis cinera)菌丝的生长[8].郑小亮等[9]发现,枯草芽孢杆菌Zl-2抑菌蛋白可以使禾谷镰刀菌菌丝形态畸形、抑制孢子萌发.MYO等[10]发现贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NKG-2产生的挥发性气体能抑制尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)等多种病原真菌生长,同时可以产生几丁质酶等抑菌物质,并通过产生吲哚乙酸(IAA)和铁载体促进番茄生长.

芽孢杆菌的生防效果与其根际定殖能力密切相关,生防菌株发挥作用的第一步就是要建立起一定的种群密度[11].尹淑丽等[12]研究表明枯草芽孢杆菌BSD-2发酵液能提高土壤中可培养细菌的数量,降低可培养真菌的数量;杨洪凤等[13]发现解淀粉芽孢杆菌CC09能够在小麦根组织的皮层细胞、细胞间隙、中柱鞘及髓腔中定殖,对小麦赤霉病防效达到90.3%.以往对根际定殖的研究主要以单一菌株为主,对复配菌株,尤其是复配菌株在烟草根际定殖趋势的研究较少.

本实验室以烟草疫霉菌为靶标病原从烟株根际土壤分离获得三株生防芽孢杆菌,分别为贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis)GY1、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)GY10以及枯草芽孢杆菌(B. subtilis)GY12.前期的研究发现,三株生防菌对烟草疫霉菌均有较好的抑制作用,且三者复配后对烟草疫霉菌的抑制效果显著高于单一菌株[14].因此本研究进一步明确了三株生防菌对烟草种子萌发的影响及三菌株复配对烟株的促生作用;并以烟草疫霉菌及链格孢菌为供试病原,对三株生防菌的挥发性气体、抑菌物质、根际定殖情况等进行了研究.

1.材料与方法

1、1 试验材料

1.1.1 供试烟草品种、病原及生防菌株 供试烟草品种红花大金元,供试病原烟草疫霉菌1号生理小种、烟草链格孢菌,供试生防菌GY1、GY10、GY12,均为本实验室保存.

1.1.2 培养基 NA、NB、PDA培养基购于海博生物;OA培养基;CAS鉴定培养基[15];蛋白酶鉴定培养基[16].

1、2 试验方法

1.2.1 菌株培养及发酵液制备 从?80 ℃冰箱中取出生防菌GY1、GY10、GY12,在不含抗生素的NA培养基上活化培养.28 ℃恒温培养箱静置培养至长出单菌落后,分别用无菌牙签挑取单菌落转移至NB液体培养基中,150 r/min、28 ℃振荡培养,獲得各菌株培养液.

1.2.2 生防菌株对烟草种子萌发和烟株生长的影响 (1)种子萌发试验:分别收集过夜培养的GY1、GY10、GY12培养液,4000×g离心5 min收集菌体,弃上清.用无菌水进行重悬,分别调节GY1、GY10、GY12菌悬液OD600为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9,烟草种子消毒后分别用不同浓度的菌悬液浸泡30 min,以无菌水浸泡为对照.在培养皿里铺双层无菌滤纸,用2 mL无菌水浸湿后将100颗烟草种子均匀点在滤纸上,将培养皿置于28 ℃恒温培养箱培养,保持培养皿内湿润,每隔12 h观察、统计种子萌发情况.(2)促生试验:离心收集过夜培养的GY1、GY10、GY12菌体并用无菌水重悬,调节菌悬液OD600为0.1,三株生防菌按照体积比1∶1∶1进行混合,烟株移栽20 d及40 d时每株20 mL复配菌液灌根,60 d后测量比较处理与CK(无菌水)株高、茎围、干质量、鲜质量、根冠比的差异,参照YC/T 142—1998《烟草农艺性状调查方法》.促生率等于100%×(处理?对照)/对照

1.2.3 生防菌株抑菌谱测定 测试病原菌有棉花立枯病、黄瓜枯萎病、花生镰刀菌枯萎病、葡萄炭疽病、番茄晚疫病、烟草赤星病、小麦赤霉病、马铃薯枯萎病病菌和烟草疫霉菌等9种病原菌,分别接种于PDA平板中心,在距离平板中心2.5 cm处均匀打4个孔,分别加OD600为0.1的GY1、GY10、GY12菌悬液和无菌水50 μL,将平板转移至28 ℃恒温箱培养4 d左右,观察抑菌效果.

1.2.4 菌株发酵上清液对烟草疫霉菌、链格孢菌的抑制作用 分别用0.22 μm细菌过滤器过滤GY1、GY10、GY12发酵上清液,将无菌过滤液置于4 ℃冰箱备用;将直径8 mm的烟草疫霉菌或链格孢菌菌饼接至OA或PDA平板,距平板中心2.5 cm处对称打两个孔,每孔加入50 μL无菌过滤液,以无菌水为对照,将平板转移至28 ℃恒温箱培养4 d,测量各处理菌落直径,检验无菌过滤液抑菌效果.抑菌率(%)等于(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100%

1.2.5 菌株产生嗜铁素和蛋白酶的能力 将10 μL菌悬液分别点在CAS培养基和蛋白酶鉴定培养基,鉴定方法参照CAS鉴定培养基法[15],蛋白酶鉴定培养基法[16].

1.2.6 菌株挥发性气体对烟草疫霉菌、链格孢菌的抑制作用 参照王静等[17]培养皿对扣熏蒸法.

1.2.7 温度和pH对菌株抑菌蛋白稳定性的影响 采用硫酸铵沉淀法(70%饱和度)分别提取GY1、GY10、GY12菌株粗蛋白,将蛋白分别在25、40、60、80 ℃处理30 min后采用平板对峙法(同1.2.3)测定其对链格孢菌的抑制作用.分别调节蛋白pH为3、4、5、6、7、8、9、10和11放入4 ℃冰箱保存,24 h后用盐酸和氢氧化钠将pH调至8.0后测定蛋白对链格孢菌的抑制作用,以无菌水为对照.

1.2.8 根际定殖情况 采用抗生素标记法[18],分别将GY1标记氨苄青霉素抗性,GY10标记利福平抗性,GY12标记链霉素抗性(标记浓度均为150 μg/mL).收集过夜培养经抗生素标记的GY1、GY10、GY12培养液,4000×g离心5 min收集菌体,弃上清.用无菌水进行重悬,分别调节GY1、GY10、GY12菌悬液OD600为0.1.共设置GY1、GY10、GY12、GY1-GY10、GY1-GY12、GY10-GY12、GY1-GY10-GY12等7个处理(复配组合按等比例混合),每株烟草20 mL菌悬液灌根.在1、5、10、15、30、60 d每处理分别取根际土1 g,置于10 mL 0.85% NaCl溶液中振荡30 min,梯度稀释后涂布于相应的抗生素(150 μg/mL)平板,统计菌落数并计算各处理中三菌株定殖数量.

2.结 果

2、1 三株生防菌对烟草种子萌发和烟株生长的影响

2.1.1 种子萌发试验 如图1A所示,用CK(无菌水)及OD600为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9的GY1菌悬液处理烟草种子后第6天,萌发率分别为45.33%、48.00%、51.00%、52.67%、66.00%及58.33%;5个浓度的菌悬液均能促进烟草种子萌发,且OD600为0.3、0.5、0.7、0.9时种子萌发率与CK相比均有显著差异(p<0.05);OD600为0.7对烟草种子萌发最有利,相较于CK提高了20.67百分点.

如图1B所示,用CK及OD600为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9的GY10菌悬液处理烟草种子后第6天,萌发率分别为45.33%、46.33%、63.00%、65.67%、40.33%及33.33%;菌悬液OD600为0.1、0.3、0.5时均能促进烟草种子萌发,且与CK相比均有显著差异(p<0.05);OD600为0.5对烟草种子萌发最有利,相较于CK提高了20.34个百分点;OD600为0.7、0.9时萌发率低于CK.

如图1C所示,用CK及OD600为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9的GY12菌悬液处理烟草种子后第6天萌发率分别为45.33%、46.33%、56.67%、60.67%、60.00%及54.33%;5个浓度的菌悬液均能促进烟草种子萌发,且OD600为0.3、0.5、0.7、0.9时种子萌发率与CK相比均有显著差异(p<0.05);OD600为0.5时对烟草种子萌发最有利,相较于CK提高了15.34百分点.

2.1.2 促生试验 促生结果如表1所示,经过复配菌GY1-GY10-GY12灌根后株高、茎围、鲜质量、干质量及根冠比与CK相比均有显著提高(p<0.05),促生率分别为14.01%,22.75%,77.19%,83.14%和14.29%,说明复配菌具有促生作用.

2、2 三株生防菌抑菌谱

如图2所示,GY1、GY10、GY12对棉花立枯病、黄瓜枯萎病、花生镰刀菌枯萎病、葡萄炭疽病、番茄晚疫病、烟草赤星病、小麦赤霉病、马铃薯枯萎病等多种真菌病害的病原菌都有一定的抑制作用.

2.3 菌株发酵上清液对烟草疫霉菌、链格孢菌的抑制作用

如图3所示,GY1无菌过滤液对烟草疫霉菌有抑制作用,抑菌率为65%,而GY10、GY12无菌过滤液对烟草疫霉菌没有抑制作用;GY1、GY10、GY12无菌过滤液对链格孢菌有较好的抑制作用,抑菌率均达到60%以上,分别为71.79%、67.50%、61.07%,与CK(无菌水)相比均有显著差异(p<0.05),其中GY1无菌过滤液的抑制效果最好.

2.4 菌株挥发性气体对烟草疫霉菌及链格孢菌的抑制作用

对扣试验结果如图4所示,GY1、GY10、GY12挥发性气体对烟草疫霉菌菌丝生长均有抑制作用,抑菌率分别为57.98%、55.95%、57.50%,菌丝生长变弱,与CK(无菌水)有显著差异(p<0.05),但三者之间差异不显著.GY1、GY10、GY12挥发性气体对链格孢菌菌丝生长有抑制作用,抑菌率分别为63.78%、73.33%、76.22%,菌丝生长变弱,与CK有显著差异,同时GY10、GY12抑菌效果较好,与GY1有显著差异.

2、5 菌株产生嗜铁素和蛋白酶的能力

如图5所示,GY1、GY10、GY12在CAS平板上都产生了晕圈,表明三菌株都能产生嗜铁素,其中GY10晕圈直径最大;GY1、GY10、GY12在蛋白酶平板上均产生透明圈,表明三株菌都能够分泌蛋白酶.

2、6 温度和pH对生防菌株抑菌蛋白稳定性的影响

如图6所示,GY1蛋白在25、40、60、80 ℃, 4个温度下处理后与链格孢菌对峙,菌落直径与CK(无菌水)相比均有显著差异(p<0.05,下同);40、60 ℃处理时链格孢菌菌落直径分别为1.47及1.57 cm,与25 ℃(室温)相比差异不显著,80 ℃处理时链格孢菌菌落直径为1.73 cm,与25 ℃处理相比差异显著.GY1蛋白在4个温度处理后抑菌率都在50%以上.GY10蛋白在25、40、60、80 ℃,4个温度下处理后與链格孢菌对峙,菌落直径与CK(无菌水)相比均有显著差异,抑菌率都在50%以上.GY12蛋白经不同温度处理后仍然具有较强的抑菌能力,与对照(6.73 cm)相比差异显著,但是随着温度升高,抑菌能力略有下降(抑菌率分别为52.48%、48.51%、42.57%、41.58%),但差异不显著.

如图7所示,GY1蛋白经pH 3~11过夜处理后恢复pH至8.0与链格孢菌对峙,各处理菌落直径与CK(无菌水)相比均有显著差异,pH在3~10范围内抑菌率均在50%以上.当pH为8时菌落直径最小,为1.5 cm,抑菌率最高,为59.79%;随着pH降低或升高,链格孢菌落直径均呈逐渐增大趋势.当pH升高至11时菌落直径为2.23 cm,抑菌率最低,为40.13%,与其他处理有显著差异.

如图8所示,GY10蛋白经pH 3~11过夜处理后恢复pH至8.0与链格孢菌对峙,各处理菌落直径与CK(无菌水)相比均有显著差异;当pH为8时菌落直径最小,为1.8 cm,抑菌率最高,为51.74%;随着pH降低或升高,链格孢菌落直径均呈逐渐增大趋势.当pH升高至10和11时菌落直径分别为3.07 cm和3.00 cm,抑菌率较低分别为17.78%和19.57%,与其他处理有显著差异.pH在3~9范围内抑菌率均在40%以上.

如图9所示,GY12蛋白经pH 3~11过夜处理后恢复pH至8.0与链格孢菌对峙,各处理抑菌能力与空白对照均差异显著;pH为8时抑菌活性最强,菌落直径为3.07 cm,抑菌率为54.46%;随着pH降低和升高,其抑菌活性均呈现减弱的趋势;当pH为11时抑菌活性最弱,抑菌率下降至19.80%,与其他处理差异显著.

2、7 根际定殖情况

如图10A所示,随时间推进,GY1根际定殖量在GY1-GY10、GY1-GY12、GY10-GY12、GY1-GY10-GY12 四个处理中均呈现先下降,5 d左右上升,后又下降的趋势,30 d定殖量为(1.62~2.01)×106 cfu/g,且GY1-GY10-GY12处理中GY1的定殖量相对于其他处理高;如图10B所示,GY10根际定殖量总体呈现缓慢下降的趋势,15~30 d趋于平稳,30 d定殖量为(0.65~0.93)×106 cfu/g,且GY1-GY10-GY12处理中GY10的定殖量在15、30 d时均高于其他处理.如图10C所示,GY12根际定殖量变化趋势不稳定,总体呈现先下降第5天再略上升后又下降的趋势,30 d定殖量为(0.52~0.63)×106 cfu/g.总体上三株生防菌在烟草根际的定殖趋势基本一致.

3.讨 论

生物防治是植物病害防控的重要措施,生防细菌是一类重要的生防资源.由于具有较强的环境胁迫耐受性、促进植物生长的能力和抗菌活性,芽孢杆菌是市场上商品化应用最广泛的生防菌株.本研究中,贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis)GY1、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)GY10以及枯草芽孢杆菌(B. subtilis)GY12对棉花立枯病等多种病原菌具有显著的抑制作用.进一步的研究发现,GY1、GY10、GY12均能产生嗜铁素以及蛋白酶等抑菌物质,这与戴秀华等[19]报道的解淀粉芽孢杆菌Lx-11通过产生蛋白酶、纤维素酶和嗜铁素等抗菌物质抑制植物病原真菌的结果是相似的.黄娜等[20]发现枯草芽孢杆菌的分泌蛋白对供试的6种植物病原真菌具有抑制作用,该蛋白在80 ℃处理30 min后仍有抑菌作用,在pH 4~7仍保持一定的抑菌活性.本研究也发现,GY1、GY10和GY12粗蛋白对链格孢菌具有显著的抑制作用,且对高温(80 ℃,30 min)及酸性具有较强的耐受性,尤其是GY1和GY10粗蛋白在pH下降至3时抑菌率仍在40.0%以上.释放挥发性有机物也是生防微生物的一种生防机制.王静等[17]发现短小芽孢杆菌AR03产生的挥发物对烟草疫霉菌和链格孢菌菌丝生长和孢子萌发具有不同程度的抑制和致畸作用.本研究中,GY1、GY10、GY12产生的挥发性物质可以显著抑制烟草疫霉菌以及链格孢菌菌丝的生长和扩张.上述结果对于疫霉菌和链格孢菌的防控提供了新的菌种资源.

促进植物生长是生防菌的一个重要特性.研究中我们发现,利用GY1、GY10、GY12发酵液浸泡烟草种子可以显著促进种子的萌发,推测菌株在生长过程中可能分泌一些生长素类物质,该结果与之前报道的烟草促生试验结果是一致的[14].目前利用生防菌开展促生防病的研究多数以单一菌株为主[21],利用多菌株复配进行防病促生试验的研究较少,本试验通过将三株不同类型的生防芽孢杆菌复配进行盆栽试验,发现三株生防菌发酵后混合灌根能显著促进烟株的生长,株高、茎围、鲜质量、干质量、根冠比等与CK相比显著提高.

土壤中微生物类群的丰富程度可以较敏感地反映土壤中生化反应的方向和强度[22],生防菌能否在作物根际有效定殖是发挥作用的前提和关键[23],等[24]研究表明蜡质芽孢杆菌AR156处理辣椒60 d后,在辣椒根际土壤中仍然能够检测到菌株的存在,说明AR156在辣椒根围具有较好的定殖能力.本研究表明,GY1、GY10、GY12均能够在烟株根际良好定殖,而且研究中首次发现GY1-GY10- GY12复配与各菌株单独处理相比,复配后可以提高各菌株在根际的定殖能力,表明多菌株复配相对于单一菌株在根际定殖更具优势,推测原因是三株生防菌相容性好,相互之间竞争、抑制作用弱,且三株生防菌具有不同的系统分类地位,生长代谢及对养分的需求存在差异,复配后菌株间的相互作用以及代谢物质增强了各菌株对复杂环境的适应性.该研究为生防菌剂的复配开发及高效利用提供了思路.

4.结 论

芽孢杆菌GY1、GY10、GY12抑菌谱广,对棉花立枯病、黄瓜枯萎病等9种病原菌具有抑制作用;三株生防菌的发酵上清液、挥发性有机物、粗蛋白均可抑制烟草疫霉菌和链格孢菌的生长.三株生防菌的粗蛋白对高温具有强的耐受性,且都對pH不敏感.促生及根际定殖试验结果表明,GY1、GY10、GY12菌悬液单独浸泡烟草种子可以促进种子的萌发,将三株生防菌复配后灌根不仅能促进烟株生长还能提高菌株的根际定殖能力.上述结果表明,芽孢杆菌GY1、GY10、GY12具有非常好的生防应用及开发前景.

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芽孢引用文献:

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