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目录

1. 第一篇plc技师论文范文参考：煤炭企业高技能人才需求与培养保障体系研究
2. 第二篇plc技师论文样文：高等职业教育学生学业评价研究
3. 第三篇plc技师论文范文模板：口腔正畸弓丝成形规划及弯制机器人研究
4. 第四篇plc技师论文范例：符应理论视角：职业教育与中国新产业工人的生产
5. 第五篇plc技师论文范文格式：癌蛋白p28~(GANK)对肝癌前体细胞的调控作用及机制研究

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第一篇plc技师论文范文参考：煤炭企业高技能人才需求与培养保障体系研究

目前我国煤矿价格持续低迷,煤炭企业形势十分严峻,煤矿企业发展与人才管理面临挑战,对我国煤炭企业高技能人才需求与培养保障管理进行研究具有重要现实意义.本文为有效处理高技能人才的培养与保障问题,以淮北矿业为研究对象,针对其高技能人才管理中存在的问题和关注重点,对煤炭企业高技能人才的需求预测、培养体系与保障激励体系进行研究.首先,对高技能人才现状进行分析,基于系统动力学建立了煤炭企业高技能人才的需求分析模型,并设置了4种情形对高技能人才需求进行了仿真模拟.其次,结合煤炭企业的实际情况和发展规化目标,构建了煤炭企业高技能人才体系,内容包括培训、考核、选拔、人才交流和成长管理五个方面,并提出了基于AHP和模糊综合评价方法的高技能人才评价方法；最后,分别从构建内部环境、宽带薪酬激励制度和“星员工”激励制度建立了煤炭企业高技能人才保障体系.

第二篇plc技师论文样文：高等职业教育学生学业评价研究

建国后高等职业教育在我国的发展从1980年到现在仅仅三十多年的时间,全国独立设置的高职高专院校从1998年的432所截止到2010年已增至1239所,每年以20%-40%的速度迅猛增长,据统计在2009年,全国高职院校在校生人数达964.8万人,比1999年增长了8.2倍；“全国高等职业教育招生数达313.4万人,比1998年增长了6倍多,超过本科生的招生规模,伴随着高等职业教育快速发展,中国高等教育毛入学率已由2002年的15%提高到2008年的23%,为我国在21世纪初实现高等教育大众化的历史性跨越起到了基础性和决定性的作用”①,高等职业教育成为了高等教育的“半壁江山”.作为高等教育的一种类刑,高等职业教育乘持着能力本位将培养目标定位在“技能型”人才,高等职业院校学生学业考试也试图在知识和技能两个方面与传统的技能考评和鉴定的体系接轨,建立相应的制度体系和评价模式.

在经济技术飞速发展,职业变动频繁和职业内涵日趋模糊的现代社会,外显的、单一岗位技能化取向的职业能力本位日益遭到挑战,建构主义和人本主义的兴起促使了新职业主义对人内在、可持续职业发展与成长的关注,高等职业教育到底要培养什么样的人这个问题在三十多年的发展中伴随着校企合作和课程改革也在不断探索,“从技能型人才到高技能人才,从经验技术和动作技能为主的机械操作者到以理论技术和智力技能为主的技术应用性人才,从高级技工、技师、高级技师等传统的高级技能型人才到适应全球化的知识经济时代要求的现代技术型人才”.②从单一岗位的封闭任务下的“会操作”到基于职业领域典型工作任务下的“会工作”,其实质是高等职业教育能力本位的重构,从技能化取向的能力本位转向为综合职业能力的本位,高等职业教育对高技能型人才的培养必然要指向综合职业能力,对学生学业的评价必须要针对跨职业、跨岗位的综合职业能力依据新的理论基础和操作模式来进行.

反观当前我国高等职业教育学生学业评价现状与职业教育学习领域课程改革(工学做一体化课程)目标要求和职业领域对人的能力综合化要求则相去甚远,传统的考试体系已经无法诊断与评价基于典型工作任务中对完整工作过程设计与实施这样的“知识与技能”.如何建立适应当前改革的学生学业评价体系便成为一个亟待解决的问题,本文运用文献法、历史法、案例法和比较研究等方法,在充分占有第一手资料和实践调查的基础上对这一问题进行了剖析.首先从历史维度和中外对比两个方面对职业教育学生学业评价进行了梳理和剖析,分析的基本框架为评价制度、评价主体、评价内容、评价方法、评价标准以及评价功能.在描述事实过程中力求对其背后的“职业能力”及其价值预设和操作模式进行全面解读.历史维度的职业教育学生学业评价一直以考试为话语方式,其知识+技能的实践方式迄今仍在深刻的影响着当前高等职业教育学生学业评价的理论和实践,对其考察主要从我国古代学徒制考试到晚清学校制度化职业教育考试发展至民国职业教育考试,最后到当代高等职业教育考试；中外对比的维度则从“职业能力本位”背景下当今世界职业教育最为发达的德国职业教育考试和英语文化圈国家有代表性的英国职业教育考试为例进行了对比分析.

基于历史经验的反思和中外对比,结合目前职业教育课程改革以及当前企业人力资源所采用的评价模式、以及职业能力测评技术的最新发展,提出了高等职业教育学生学业评价的体系,包括评价的理论基础、评价制度设计、评价内容、评价方法、评价标准以及评价主体构成.认为高等职业教育学生学业评价的理论基础应当超越传统的行为主义而以理性主义哲学和建构主义的学习论和评价论作为理论基础,评价制度设计围绕职业领域典型工作任务在三个层面进行制度化设计,评价内容以具有完整工作过程结构的职业典型工作任务为基础和来源结合学习性工作任务设计,评价方法以先前学习认定和关键事件访谈法,根据学生对完整工作过程的系统性构思的方案阐述、论证和实施进行评价,评价标准既要体现对学生全面发展的教育性要求,又要体现顾客、委托方、社会组织包括国家法律法规的专门性要求的三维一体全面性评价原则.因而作为评价主体必须要有这些不同价值取向的主体构成,因典型工作任务和完整工作过程所涉及的部门和人员都要纳入到评价主体之中从而形成多元的评价主体.

第三篇plc技师论文范文模板：口腔正畸弓丝成形规划及弯制机器人研究

随着我国社会的发展和人民生活水平的不断提高,人们越来越注重口腔健康的问题；健康、整齐的牙齿不仅能给人以良好的第一印象,更能提高咀嚼功能、保护口腔健康.通常,在进行牙齿矫正过程中,矫正弓丝的弯制是基于医生手工操作的,该过程不仅效率低,而且劳动强度大；医生需要边弯制弓丝边与口腔模型相比对,不断调整弯曲角度使其成形；弓丝在反复弯折的情况下很容易发生断裂.本文提出在对弓丝成形规划进行分析的基础上,采用机器人进行弓丝弯制加工,利用机器人的位姿精确控制能力克服手工弯制弓丝的缺点,提高正畸弓丝的弯制精度和效率.

搭建了弓丝弯制机器人本体及其控制系统.基于成形弓丝闭隙曲弯制工艺的分析,确定了弓丝弯制机器人的构型和布局；设计了弓丝弯制机器人的总体机构、弯曲模具机构和弓丝支撑机构,并对关键零部件进行了有限元强度分析；以PC+PMAC的主从式控制方式提出了弓丝弯制机器人控制系统方案,确定了硬件组成结构,并编制了系统配置程序、回零程序和弓丝弯制运动控制程序.

规划了弓丝弯制机器人加减速方案.为了保证弓丝弯制机器人的精确运动,降低运动过程中的冲击和残余振动,提出分段自调整加减速分配方案.首先,基于弓丝弯制机器人运动平台的物理参数构建了三阶纯S加减速曲线；其次,以此加减速过程所确定的运动距离为标准,当弓丝弯制机器人的运动距离大于该标准时,提出采用5段S加减速曲线的加减速规划方法；再次,当弓丝弯制机器人的运动距离小于该标准时,提出采用修正的S加减速曲线规划方法.通过仿真研究,验证了提出的加减速方法的平稳性和柔顺性.

规划了弓丝成形控制节点信息.建立了标准正畸弓丝数学模型和带外展弯的目标正畸弓丝数学模型,在此模型的基础上,提出增量法和有限点展成法对机器人弯制弓丝成形过程中的控制节点位置和数目进行了规划；分别将两种规划方法所得到的控制节点拟合成曲线,与理想目标弓丝曲线进行了误差对比分析；编制算法耗时程序对两种算法进行了效率分析；结果表明无论是规划精度还是算法效率,有限点展成法均优于增量法；最后在规划出的控制节点位置和数目的基础上采用斜率法对各控制节点处需要弯制的角度进行了计算.

研究了弓丝弯曲回弹机理.针对弓丝弯制属于大曲率弯曲变形的特点,从考虑弯曲过程中中性层内移和弯曲力臂影响的角度出发,将弓丝弯曲分为强弹性弯曲阶段和强塑性弯曲阶段,以弓丝拉伸试验所得材料本构模型为基础,分别建立了方形截面弓丝和圆形截面弓丝的弯曲回弹理论计算公式.从建立的弯曲回弹理论计算公式可以看出,回弹角随弯曲角的增大而增大；在小角度弯曲度时回弹角占总弯曲角的比例较大；在大角度弯曲时,回弹角占总弯曲角的比例较小.然后,在搭建的弓丝弯制机器人实验平台上进行了正畸弓丝弯曲,并在金相显微镜下对其成形角度进行了测量,分别得到了不同弯曲角度下的回弹角度和成形角度,实验结果证明了理论计算模型的正确性和合理性.

针对一例患者的口腔参数,采用有限点展成法规划出了控制节点信息,采用斜率法规划出了节点处的弯曲角度信息,并采用弯曲回弹理论计算模型计算所得回弹角度对弯曲角度进行了修正；在此基础上以弓丝弯制机器人实验平台开展了方形不锈钢弓丝与澳丝弯制实验；对所得实验结果进行了测量并与理想成形弓丝进行了对比分析,得出了误差来源并提出了误差减少方案.

第四篇plc技师论文范例：符应理论视角：职业教育与中国新产业工人的生产

研究农民工问题的立意要与中国特定的工业化过程相联系,而具体工人的生产与不同管理制度和生产关系的工厂制度相结合.中国农民工向新产业工人转换有着特殊的社会背景,但与世界主要国家工业化相比较也具有共同点,都是符合工业化进程对劳动力有着数量和质量上的需求这一客观规律.自工业革命起,工厂制度作为资本积累方式和劳动生产组织在国家干预、市场力量、劳动过程共同作用之下发生着变迁,根本目的在于控制经济系统的稳定性和社会阶级结构的再生产.鲍尔斯与金蒂斯归纳了美国历史上工厂制度变迁与教育制度改革之间的相互作用,提出了联系教育过程与劳动过程的“符应原则”.狭义上的“符应原则”指学校教育的社会关系与工厂劳动的社会关系之间的对应性,而广义的“符应原则”指国家通过学校教育将潜在劳动力统合至社会经济结构中去.中国的中等职业学校是为工业化提供产业工人的教育机构,近年来农村户籍的学生逐渐成为中职教育的主体,毕业之后成为企业一线用工的主体.但鉴于工业社会中教育层次与职业层次的联系,中等职业教育一直存在“阶层再制还是劳动力提升?”的争论.学校和工厂都已成为培养产业工人的地方,本文应用“符应原则”运行机制从知识技术、个性品质、阶层意识三个方面对杭州下沙经济技术开发区的中职校工（生）在中职学校、制造业工厂接受的训导进行分析,应用“符应原则”传送机制对这一潜在劳动力成为产业工人的过程进行区分,从中反映出国家意识形态、工厂制度的强制与同意因素.

在工业化的推动下,劳动方式的转变主要体现为农村剩余劳动力转向现代化的工业劳动.但在改革开放之前,中国的工业体系基本上对农村劳动力采取封闭措施,建设社会主义市场经济和发展劳动力市场才使得农村劳动力成为产业工人的一员.与这段历史相似的是,中国的中等职业教育一开始只招收少量农村家庭的精英子女,1992年之后开始对农村人口放开,但之前的分配工作、落户等政策不再具备,中等职业教育逐渐成为一种生存教育.工业生产体系内部是多元化的,即使是在制造业工厂,工作岗位也分若干层次,而教育与职业之间的联系在所有工业社会中本质都是一样的,有着很强的相关性.“符应原则”的传送机制就是要将社会身份不同的潜在劳动力分配到分层化的教育格局和劳动格局中去.中国建立了不同层次的教育机构,对应着不同职业发展的可能性,并通过教育分流进行分配.农村家庭子女由于受限于各种资本,客观的结果是其进入中等职业教育的比例逐年扩大,而其毕业后从事的职业层次有降低的趋势,难免引起教育再生产的讨论.工业化带来的另一相似影响是企业与工人之间是资本--劳动力的市场化劳动关系,在国际分工领域,中国位于产业链的中后段,国际资本强调的是弹性的积累,在劳动领域表现为低层次工人工作的临时性和不稳定性.中国制造业需要在竞争中壮大,提升产业工人的人力资本成为转型的关键,这也对中职校工（生）提出了更高的要求.

现代工厂往往通过劳动分工和等级区分对企业进行复杂控制.统治阶级在教育政策有两大目标：一是劳动力的再生；二是生产关系的再生.“符应原则”在学校层面的运行机制在中国的中等职业学校也显示了它的作用：在知识技术训导方面,中职学生由于性别、家庭经济条件、个人喜好等因素,选择的专业也不尽相同,这对其进入制造业一线生产岗位产生了影响；在个性品质训导方面,中职学生特别强调纪律约束和规范内化,这与之后的工作要求是对应的；在成层意识训导方面,中等职业教育宣传的是蓝领文化,通过隐性课程来塑造学生的价值观,中职学生在此训导之下分化为积极、消极制造两类群体.进入工厂之后,极大多数中职校工（特别是流水线生产上的用工）被安排在劳动等级制分工的较低层次,工厂对等级制分工所需要的知识技术、个性品质有着更为明确的要求,中职校工（生）必须接受工厂的再次训导,职业教育再次发挥了作用.与学校教育的相对公平而言,工厂的训导更带有技术、官僚控制的意图.在结构的限制之下,部分上进的中职校工（生）寻求工厂外部的职业教育资源,通过提升人力资本达到符合职业层次提高所需要的条件.

工厂制度的物质基础是资本对生产资料的所有权和对劳动过程的控制,与发达国家的工厂制度的变迁相比,中国沿海开发区的制造业工厂在劳动分工、管理制度、劳动力市场分割等方面呈现趋同性,当然也有自身的一些特点.下沙开发区的制造业有四大行业,每个行业的一线生产的工种基本上可以分为普工和技工.“符应原则”的传送机制在中职校工（生）被分配至东部沿海开发区时出现了新的内容,与制造业专业关系不大的中职校工（生）主要通过劳务派遣形式来工厂充当普通操作工人,地区差异成为异地工作制造同意的基础.在市场环境下,劳动力在工厂内部转换为劳动,光靠强制手段是不行的,必须结合同意才能达到有效生产的目的.技术控制和官僚控制成为下沙制造业工厂普遍采用的控制方式,这一控制方式的合法性来自于工业社会普遍适用的技术决定论--选优任能论.工厂对处于劳动等级制分工不同位置的中职校工（生）进行再次整合,并促使其形成与工作相联系的阶层意识.而整合的过程同时也是分化的过程,中职校工（生）发挥个人主动性追求个人的利益时也在维护着工厂的利益.由于企业职级的金字塔结构是既定的,中职校工（生）最终成为一线生产的主体,部分中职校工（生）经过时间磨砺成为技术工人和基层管理者,从而实现了中等职业教育的培养的目的和“符应原则”所反映的劳动等级制分工的再生产.

农村户籍的中职校工（生）要成为真正意义上的产业工人,需要一系列稳定性因素的保障.受葛兰西思想的影响,鲍尔斯、布洛维从教育过程与劳动过程两方面探讨阶级结构稳定化的作用机制,强调国家干预导致霸权制度的出现.将青年人统合到社会经济结构中去是“符应原则”传送机制的功能,而这一功能的发挥与工厂制度的变迁紧密联系.下沙开发区的工厂制度正发生着重构,这一案例体现了政府、资方、劳工各自的变化情况.总体上说,开发区的工厂制度是向着好的方面发展,当然,在发展过程中也不可避免出现若干问题.职业是工业社会中进行社会分层的主要依据,教育--职业--阶层是分层与流动的逻辑.调查数据显示：中职校工（生）在下沙开发区制造业初步形成了稳定的职业群体,标志着这一群体向产业工人进一步的转化,从而说明中等职业教育的有效性.整个工业社会都力图将工人变为具有权利与义务的工业公民,而不是阶级的一员来建构,但“符应原则”最终揭示的是“少数人控制着大部分生产资料,大多数人只有劳动力”的社会现象,对这一社会现象的理解必须重返

第五篇plc技师论文范文格式：癌蛋白p28~(GANK)对肝癌前体细胞的调控作用及机制研究

研究背景和目的

前体细胞,又称为干细胞,是一类具有自我更新和多向分化潜能的特殊细胞,前体细胞的自我更新和分化受到严格调控,如果这种调控机制发生障碍,细胞就会相对无止境地生长、繁殖,形成肿瘤.由此可知,正常前体细胞可能通过累积基因突变获得不确定的分裂繁殖能力,转化为肿瘤前体/干细胞(tumor-initiatingcells/cancer stem cells,T-ICs/CSCs).肿瘤前体细胞是存在于肿瘤组织中的少部分具有干细胞性质的细胞群,具有自我更新能力和不确定分化程度的潜能,是形成不同分化程度的肿瘤和肿瘤不断生长扩散的根源.肿瘤前体细胞学说的提出是人类认识肿瘤本质的一大进步,为肿瘤的发病机制、早期诊断以及恶性肿瘤根治方法的研究提示了新的方向.目前在人急性粒细胞白血病细胞、乳腺癌细胞和脑肿瘤细胞中发现并已分离出肿瘤前体/干细胞.然而,对于肿瘤前体细胞的调控机制存在着不同的理论,被广泛接受的是异常信号传导通路、非整倍核型发生、原癌基因激活与抑癌基因失活和端粒酶耗损理论等.所以,进一步研究肿瘤前体细胞的调控机制将有助于揭示肿瘤形成的分子机制,有助于寻找针对肿瘤前体细胞进行肿瘤治疗的多个靶位,为根治恶性肿瘤提供新的治疗思路.

2000年Fujita等通过差减杂交法从人的肝癌组织cDNA文库中发现,p28~(GANK)是一个在人肝细胞癌组织中相对特异性高表达的癌基因；目前新发现该基因还高表达于人食管鳞状细胞癌、结肠癌、胰腺癌以及肺癌.近年来发现p28~(GANK)基因编码的蛋白是人26S蛋白酶体（26S proteasome）调节亚单位19S/PA700复合物的一种非ATP酶亚基,它与CDK4结合并参与CDK4/CyclinD1/p16INK4α/Rb1/E2F-1信号转导通路的调节,驱动肿瘤抑制蛋白Rb1的核内磷酸化失活和E2F-1的释放,促使细胞由G1期向S期转化,进而紊乱了细胞周期；而且外源性转入癌基因p28~(GANK)使其高表达的NIH/3T3细胞株可以使裸鼠荷瘤.最近,Nagao等人通过酵母双杂交发现黑色素瘤抗原MAGE-A4能与癌蛋白p28~(GANK)特异性结合并抑制p28~(GANK)成瘤活性.此外,癌蛋白p28~(GANK)能与泛素蛋白连接酶MDM2相互作用,调节P53的泛素化及降解,进而抑制P53介导的细胞凋亡.临床统计提示,癌蛋白p28~(GANK)的表达水平与肝癌及食管癌患者的预后相关,但是目前该基因如何促进肝癌及食管癌发生发展的作用机制仍未明了.

我室于2001年在国内首次克隆了癌基因p28~(GANK),并通过大量的临床肝癌样本的免疫组化检测,确认其表达蛋白p28~(GANK)可能为目前已知的具有一定肝癌细胞特异性的癌蛋白.我组前期研究发现干扰肝癌细胞中p28~(GANK)的表达可明显抑制细胞的增殖并可在体内外诱发肿瘤细胞凋亡,p28~(GANK)直接结合NF-κB/RelA,加速NF-κB出核,抑制其转录活性.此外,大鼠2-AAF/PH模型诱导的肝卵圆细胞活化过程中伴随着p28~(GANK)的mRNA和蛋白表达水平均上升、Rb磷酸化降解以及CDK4/CyclinD1的活化,提示p28~(GANK)可能在肝卵圆细胞介导的肝再生及肝卵圆细胞的细胞周期中发挥着重要作用,我室新发现OV6可以做为肝癌前体细胞的标志物,并研究了Wnt/β-catenin信号通路在OV6阳性细胞亚群中的重要调节作用.我们观察到OV6阳性的肿瘤性肝前体细胞中p28~(GANK)的mRNA表达升高,而Rb和p53蛋白表达下降,这些都提示p28~(GANK)可能与正常和肿瘤性肝前体细胞的活化存在某种联系.肿瘤相关蛋白调控肿瘤前体细胞的增殖和分化可能是肿瘤干细胞调控的机制之一,但是目前尚未见到癌蛋白p28~(GANK)调控肝癌前体细胞的相关报道,因此,探讨癌蛋白p28~(GANK)调控肝癌前体细胞活化的分子机制是本课题研究的重点,旨在加深我们对肿瘤生物学的认识,为研发新的肿瘤治疗药物和方法提供理论依据.

实验方法：

1.载体及病毒构建：构建过表达p28~(GANK)慢/腺病毒载体、由RNAi介导的低表达p28~(GANK)的慢/腺病毒载体及对照慢/腺病毒载体,在293T/293A细胞系中进行病毒包装、扩增以及滴度测定.

2.建立稳定细胞系：构建过表达及RNAi引起低表达p28~(GANK)的*MC-7721、HCC-LM3、Huh7、HepG2等稳定肝癌细胞系.

3.免疫磁珠分选：以OV6、CD133等作为肝癌前体细胞标志物,磁珠分选出肝癌前体细胞,比较p28~(GANK)在肝癌前体细胞以及非肝癌前体细胞中的表达差异,比较在过表达及低表达p28~(GANK)引起的肝癌前体细胞中其他干细胞相关基因的变化.

4.流式检测：

(1)流式双标OV6、CD133、EpCAM等干细胞表面标志物检测过表达及低表达p28~(GANK)的*MC-7721、HCC-LM3、Huh7、HepG2等稳定肝癌细胞系表面标志物差异.

(2)将过表达及低表达p28~(GANK)的稳定肝癌细胞磁珠分选出肝癌前体细胞,7天后行流式检测其干细胞比率,检测p28~(GANK)对干细胞分化能力的影响.

(3) spheroid克隆形成实验：将过表达及低表达p28~(GANK)的*MC-7721、HCC-LM3、Huh7、HepG2等稳定肝癌细胞以3000/孔接种低粘附板,检测p28~(GANK)对干细胞自我更新能力的影响.

5.耐药实验：检测阿霉素、顺铂、5-FU、丝裂霉素等化疗药物对过表达及低表达p28~(GANK)的稳定肝癌细胞系在细胞增殖、克隆形成、干细胞比率、干细胞相关基因表达变化等方面的影响.

6. NOD/SCID鼠皮下荷瘤实验：磁珠分选出*MC-7721细胞中OV6阳性的肝癌前体细胞,分别感染过表达p28~(GANK)以及由RNAi介导的低表达p28~(GANK)的慢病毒以及相应的对照病毒,行NOD/SCID鼠皮下荷瘤,统计肿瘤发生率、瘤体体积、肺转移灶数目、并行皮下瘤组化检测相应分子变化.

7.资料收集及统计方法：

(1)随机选取2001.9~2006.10年在我院行肝癌根治术的原发性肝细胞癌患者标本130例,制作组织芯片,并收集完善病史及随访资料,以免疫组化方法检测组织芯片标本中p28~(GANK)、OV6的表达,并统计分析p28~(GANK)、OV6的表达与肝癌患者各项临床特征（肿瘤大小、血管侵犯、肝内播散和远处转移等）及远期生存（无瘤生存率、总生存率和生存时间等）的关系.

(2)将45例肝癌手术病人的原代细胞接种于低粘附板,收集7-10天后形成的spheroid,行real-time PCR,检测相应干细胞标志物变化.

(3)用SAS9.1.3软件进行统计分析.结果以median (Q1-Q3)表示.χ2检验或Fisher确切概率法用来进行定性资料的比较.组间定量分析用wilcoxon配对秩检验.相关性分析采用spearman秩相关.累计生存和复发率的计算采用Kaplan-Meier,生存曲线用Log-rank绘制并进行生存分析.P<,0.05视为统计显著.

8.机制探索：

(1)利用腺病毒在一系列肝癌细胞系中过表达或干扰p28~(GANK),检测核转录因子Oct4（POU5F1）的表达情况；NOD/SCID鼠皮下瘤组化检测Oct4表达变化；在134例肝癌样本中利用western blot方法检测p28~(GANK)和Oct4的蛋白表达情况,并利用Quantity One软件进行半定量分析,统计两者表达的相关性；以免疫组化方法检测上述130例肝癌病人组织芯片标本中p28~(GANK)、Oct4的表达,统计两者相关性,并统计分析p28~(GANK)高表达病人中Oct4的高、低表达对远期生存（无瘤生存率、总生存率）的影响.

(2)在293T细胞中转染Myc-p28~(GANK)、Flag-Oct4和HA-WWP2质粒,western blot检测Oct4的表达情况以及p28~(GANK)对Oct4泛素化程度的影响、免疫共沉淀检测上述分子有无相互作用并在*MC-7721肝癌细胞系中验证p28~(GANK)和内源性WWP2的相互作用.

(3)在293T细胞中转染一系列p28~(GANK)缺失突变体和HA-WWP2质粒,寻找p28~(GANK)和WWP2的相互结合位点.

(4)在低表达以及正常表达p28~(GANK)的OV6阳性的*MC-7721肝癌前体细胞中转染PCDNA3.1-Oct4及对照质粒行spheroid克隆形成实验,验证p28~(GANK)通过Oct4对肝癌前体细胞发挥调控作用.

实验结果:

1.在130例肝癌病人组织芯片标本中p28~(GANK)、OV6的表达呈正相关(r等于0.2483, P等于0.0044), p28~(GANK)高表达的病人中OV6阳性的比率更高；p28~(GANK)、OV6双阳性的病人预后（无瘤生存率、总生存率）较差.

2. p28~(GANK)在以OV6阳性/CD133阳性的肝癌前体细胞以及具有自我更新能力的spheroid中呈现高表达；在肝癌病人原代细胞形成的spheroid中,p28~(GANK)与干细胞相关基因CD133、EpCAM的表达呈正相关（分别为r等于0.52, P等于0.03以及r等于0.49, P等于0.0006）.

3. p28~(GANK)的过表达可提高肝癌前体细胞的干细胞特性,包括前体细胞标志物以及干细胞相关基因的表达、肝癌细胞系中OV6、CD133以及EpCAM等干细胞标志物的比率、自我更新能力、延迟干细胞分化能力、以及对化疗药物的耐药性、NOD/SCID鼠体内成瘤性以及肺转移能力.

4. LV-mip28~(GANK)2#具有更好的p28~(GANK)干扰效果,干扰p28~(GANK)的表达可减弱上述肝癌前体细胞的干细胞特性.

5. p28~(GANK)对肝癌前体细胞的调控作用主要是提高前体细胞的增殖能力；p28~(GANK)在前体细胞中的抗凋亡作用不明显.

6. p28~(GANK)可在蛋白水平上调Oct4的表达；western blot显示在134例肝癌样本中p28~(GANK)和Oct4的表达呈正相关(r等于0.4939, P <,0.0001)；在130例肝癌病人组织芯片标本中p28~(GANK)、Oct4的表达呈正相关(r等于0.5217, P <,0.0001),p28~(GANK)高表达的病人（n等于41）中Oct4的高表达使病人预后（无瘤生存率、总生存率）更差.

7.在293T细胞中转染Myc-p28~(GANK)质粒可逆转HA-WWP2对Flag-Oct4的降解作用,提高Oct4的表达；免疫共沉淀检测发现p28~(GANK)可减弱WWP2和Oct4之间的相互作用以及WWP2对Oct4的泛素化降解；内外源性实验证实p28~(GANK)和WWP2之间存在相互结合作用；p28~(GANK)的C端以及N端可能是与WWP2相互结合的位点；p28~(GANK)与Oct4之间无相互结合作用.

8.在低表达p28~(GANK)的肝癌前体细胞中过表达Oct4可减弱由于干扰p28~(GANK)造成的对肝癌前体细胞自我更新能力的下降.

9. *T信号通路以及Wnt/β-catenin信号通路可能部分参与了p28~(GANK)对肝癌前体细胞的正性调控；p53与Rb的状态不影响p28~(GANK)对肝癌前体细胞的调控.

结论:

本研究从病人样本、细胞水平以及动物体内水平证明p28~(GANK)对肝癌前体细胞存在正性调控作用.p28~(GANK)通过与E3泛素连接酶WWP2结合,阻碍了WWP2与Oct4的结合以及对后者的泛素化降解,在蛋白水平上调Oct4的表达,从而提高肝癌前体细胞的干细胞特性,包括前体细胞标志物以及干细胞相关基因的表达、肝癌细胞系中OV6、CD133以及EpCAM等干细胞标志物的比率、自我更新能力、延迟干细胞分化能力、以及对化疗药物的耐药性、NOD/SCID鼠体内成瘤性以及肺转移能力.干扰p28~(GANK)的表达可抑制肝癌前体细胞的干细胞特性,从而减缓肝细胞癌的进展过程.

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