《克氏原螯虾螺原体病原的发现与诊断》
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摘 要：作为一种原核微生物,螺原体个体微小、形态多为螺旋状且不含细胞壁,大多存在于植物、昆虫中.近些年发现一种新型螺原体,会造成中华绒螯蟹的“颤抖病”,且对其他水生甲壳动物都表现出广泛的侵染性,如克氏原螯虾.于此,寻找一种反应灵敏的定量方法防治中华绒螯蟹“颤抖病”成为当前的研究热点.明确螺原体在克氏原螯虾体内的增殖规律,能够完善水生甲壳动物螺原体疾病的监管,也将有助于其他淡水甲壳类动物螺原体流行病学的研究.
关键词：克氏原螯虾;螺原体;增殖规律
中图分类号：S945.1 文献标志码：A 文章编号：2095-2945（2020）17-0083-02
Abstract： As a prokaryotic microorgani, spiroplaa is all, spiral in shape and does not contain cell wall, and mostly exists in plants and insects. In recent years, a new type of spiroplaa has been found, which can cause "trembling disease" of Chinese mitten crab and show extensive infection to other aquatic crustaceans, such as Procambarus clarkii. Therefore, to find a sensitive quantitative method to control tremor disease of Eriocheir sinensis has become the current research focus. Understanding the proliferation rule of spiroplaa in Procambarus clarkii can improve the supervision of spiroplaa diseases in aquatic crustaceans and will also contribute to the epidemiological study of spiroplaa in other freshwater crustaceans.
Keywords： procambarus clarkii; spiroplaa; proliferation rule
1 克氏原螯虾的发展现状
克氏原螯虾（Procambarus clarkii）,俗称小龙虾,在分类上隶属于节肢动物门（Arthropoda）,甲壳纲（Crustacea）,十足目（Decapoda）,螯虾科（Cambaridae）,原螯虾属（Procambarus）.原产于墨西哥东北部和北美中南部[1],后由日本引进,20世纪30年代正式传入我国.作为一个抗逆性极强的水生物种,自然环境下,克氏原螯虾能够适应10℃乃至30℃的温度条件,甚至可以忍受零下或高温;它们通常栖息于淡水水域之中,也能适应微盐水域.正是由于这种极强的生命力、宽泛的适应力和旺盛的繁殖力,克氏原螯虾在世界各地扩散,而且一旦被引入,便会成为当地生态环境里的竞争优势种群.
极高的经济价值同样促使克氏原螯虾扩散.由于其体型大过许多淡水虾类,肉质也较为肥美,克氏原螯虾占据着世界性淡水经济虾类的巨头地位.同时,它作为一种水产经济资源物,经济效益极高、产业化前景瞩目且发展迅速,近些年来,在国内掀起了养殖热潮,大量分布在我国江苏、安徽、湖北等长江中下游地区[2],已成为最有潜力、最具特色的水产养殖品种之一.
不可忽视的是,克氏原螯虾的杂食性和资源竞争等机制正严重威胁着引入地的生物多样性.我国需要合理控制小龙虾的生产量,开展相关生态危害调查研究,避免其成为危险入侵物种.
2 螺原体的研究近况
作为一类特殊微生物,螺原体（Spiroplaa）个体极小、不含细胞壁、形态多变（尤其在指数生长期呈典型的螺旋丝状）且具有运动性,它能通过220nm的微孔滤膜,是能在人工培养基中培养的最小的单细胞原核微生物.
2.1 螺原体的分类
螺原体在分类上隶属柔膜体纲（Mollicutes）、虫原体目（Entomoplaatales）、螺原体科（Spiroplaataceae）、螺原体属（Spiroplaa）.直到上世纪70年代,人们发现它是引起植物、昆虫某些病害的祸首,但保守的以为螺原体只寄生在植物、昆虫两大类之中.之后,科学家们陆续从水生甲壳类动物体内也分离得到螺原体类微生物.在植物中,螺原体会引起玉米矮缩病（corn stunt）等病症,在蜜蜂体内可导致爬蜂病、五月病等,在水生甲壳动物体内则会引起虾蟹的“颤抖病”（tremor disease）.可见,大多数螺原体表现出严重的致病性,对各种养殖业均造成恶劣影响.
国际原核生物分类委员会在2004年曾提出螺原体多相分类（polyphasic taxonomy）的概念,通过表型（形态特征、生理学特征,生物化学特性）、基因型（GC含量、rDNA序列同源性、指纹图谱分析等）及系统发生学等信息,确定分离物和已鉴定菌株之间的关系,达到区分亲缘关系较近菌株的目的.螺原体依据血清学特性被分为43个血清组,其中包含15個血清亚组,共确立了50个以上的螺原体物种.然而,目前以血清学分析为基础的螺原体分类仍存在一些争议.
自从虾蟹螺原体被发现,其分布范围以及宿主范围便由陆地扩大到了水域.同时,螺原体对水生甲壳动物表现出的侵染性也引起了大家的关注.
2.2 螺原体生物学特性
（1）螺原体在形态结构上,没有细胞壁,呈螺旋形态.缺少细胞壁是螺原体区别于其他原核生物最重要的一点,而其独特的三明治状单位膜,使其具有螺旋形、可滤过性、可塑性甚至对某些干扰细胞壁形成的抗生素类药物产生天然抵抗性.这些独特性都使螺原体成为当前生物学研究的热点.
（2）在基因组组成上,螺原体的基因组是环状双链
DNA,但比绝大多数的原核生物要小;且碱基组成GC含量很低.通常作为终止子的UGA在螺原体中编码色氨酸,因此只有通过突变才能正常表达出目的蛋白.
（3）在代谢水平上,因为相对较小的基因组,螺原体只能编码出较少的蛋白质,同时缺少能量代谢中必须的众多基因,无论是合成生物方面还是代谢水平,自然十分低缓.故螺原体难以适应复杂环境,倘若实验室要纯培养螺原体,配置的培养基应加入固醇类营养物质.
3 虾蟹内螺原体的诊断方法
3.1 光镜快速诊断法
光镜快速诊断法针对螺原体进入血淋巴细胞后形成包涵体的特性,无需染色,直接观察血涂片便可快速准确找到受病原体感染的血细胞.这种简易快速的虾蟹活体血淋巴光镜检测方法,只需抽取微量血液即可实时监测健康和感染的虾蟹活体.光镜法也为之后的分子生物学和免疫学等其他方法奠定了检验基础.
3.2 分子生物学检测法
采用Chelex-100试剂对底泥进行提取,将纯培养的病原菌和待检测组织中的模板DNA（寄主肌肉、内脏组织、血液等）分离,该方法甚至能检测出底泥里的微量病原菌.将实验室培养的病原菌分离稀释成特定的不同浓度梯度,使用同种方法扩增后再次检测,通过比较检测样品和已知浓度的纯培养物PCR产物条带亮度,运用软件将条带明暗差异转换成数字差异,能够分析出样品中螺原体的浓度相对含量.该方法较之常规PCR手段,既灵敏快速又简单廉价,能够大批量检测虾蟹螺原体感染,进一步判断患病虾蟹的受感染程度.
3.3 螺原体的微生物学培养及电镜检测法
由于螺原体能够生长在M1D或R2特殊培养基中,碾压磨碎患病虾蟹组织后,滤过220nm的微孔滤膜,再接种到含有酚红的培养基中,3到5天后后若培养基从粉红色变为橘,则表明这些患病虾蟹体内存在螺原体病原.电镜负染观察培养基中的培养物,能够找到螺原体呈典型螺旋结构,从而准确诊断螺原体病原.
3.4 ELISA检测法及快速诊断试剂盒法
螺原体侵染虾蟹体内血淋巴后即扩散,此时采集微量血淋巴,通过传统间接ELISA方法进行有效检测.一种新型ELISA检测试剂盒灵敏度达0.573μg/mL,无论批内变异系数还是批间变异系数均低于10%,因此具备良好的稳定性.2到3小时内即可有效测出侵染“颤抖病”虾蟹体内的病原,提前诊断出螺原体的侵染情况.
4 克氏原螯虾体内的螺原体病原监测
由于螺原体疾病的爆发,小龙虾产业遭受了巨大的经济损失.以往认知中,螺原体疾病普遍存在于植物和昆虫之中,2004年首次发现它也是中华绒螯蟹“颤抖病”的病原体.除此之外,这种病原体在克氏原螯虾、罗氏虾和海水南美白对虾等其他甲壳类水生生物体内也表现出明显的扩散性.从患病小龙虾体内分离出不同的螺原体,染色后发现与其他淡水甲壳纲动物（蟹螺原体、草虾螺原体）体内的螺原体是相同的物种,从此被正式命名为Spiroplaa eriocheiri.诊断法和流行病学调查法在螺原体疾病的控制中发挥着关键作用,如何高效的控制住螺原体疾病已经成为世界范围内实现甲壳纲动物可持续生产的重中之重.
目前在甲壳纲动物螺原体的监控、检测和诊断方面主要有临床症状法、直射光显微镜法、组织病理学、原位杂交和常规PCR技术.然而,这些所有的实验方法都没有办法量化受感染组织的病原体.如何测定出病原体的增殖已然是甲壳动物疾病监控中最重要的一个环节,特别是在无病症个体的病原体检测方面,以便特定的无病原部分的生长,并做到小龙虾两地运输的监控.实时荧光定量PCR技术被广泛运用,其中最常用的两种检测方法是Taqman探针法和SYBR Green染色法.越来越多的研究人员偏向使用更简单廉价的SYBR Green染色法来进行实时PCR研究.
5 结束语
小龙虾作为我国水产养殖经济巨头,近几年来遭受着螺原体“颤抖病”的威胁,不仅在经济上形成了严重损失,也阻碍了以克氏原螯虾为代表的的水生甲壳类动物的可持续生产.因此迫切需要控制住该类螺原体疾病.在全球范围内,通过积极开展该病原在生物学特性及致病机理方面的研究,建立一个能够快速诊断并进行实时监测的综合防治技术,也将有助于进一步在其他淡水甲壳类动物中进行螺原体流行病学的研究.
参考文献：
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[7]连林坤.虾蟹螺原体病免疫组化和病理学比较研究[D].南京师范大学,2011.
此文总结，上文是关于发现方面的小龙虾和螯虾论文题目、论文提纲、小龙虾和螯虾论文开题报告、文献综述、参考文献的相关大学硕士和本科毕业论文.
小龙虾和螯虾引用文献:
[1] 小龙虾和螯虾毕业论文模板范文 关于小龙虾和螯虾类论文范文集2万字
[2] 小龙虾硕士学位毕业论文范文 小龙虾毕业论文的格式范文2000字
[3] 小龙虾和生态产业本科论文开题报告范文 小龙虾和生态产业类论文范例8000字
