《H9和H10亚型禽流感病毒二重RTPCR检测方法的建立》
本文是禽流感和二重相关专科开题报告范文跟检测方法有关论文范例.
摘 要 [目的]建立可同时鉴别检测H9和H10亚型禽流感病毒（AIV）的二重RT-PCR检测方法.[方法]根据GenBank中H9和H10亚型AIV的HA基因保守序列,分别设计2对特异性引物,优化引物之间的浓度与退火温度等条件,建立了可同时鉴别检测H9和H10亚型AIV的二重RT-PCR检测方法.[结果]特异性试验结果表明,该方法可以特异性扩增出H9和H10亚型AIV对应大小的目的条带,而对其余亚型禽流感病毒及其他禽病病原体均未扩增出特异性条带.同时,该检测方法对H9和H10亚型AIV的扩增下限均为5×104拷贝/μL.临床样品的检测结果表明其与病毒分离结果相一致（100%）.[结论]该研究建立的二重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高,可在一管内同时鉴别检测H9与H10两种亚型AIV,为H9与H10亚型AIV的监测提供了技术支撑.
关键词 禽流感病毒;H9亚型;H10亚型;二重RT-PCR
中图分类号 S852.65 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2020）05-0096-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.026
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Abstract [Objective]To establish a duplex RTPCR assay method for simultaneous detection of H9 and H10 subtype of ian influenza virus.[Method]According to the HA genes conserved sequences of H9 and H10 subtypes of ian influenza virus in GenBank database,2 pairs of specific primers were designed,the primers density and annealing template of the reaction conditions were optimized,and the duplex RTPCR assay for detection of AIV H9 subtype and H10 subtype was established.[Result]The results of the specificity test showed that this method could specifically amplify the target bands corresponding to H9 and H10 subtypes AIV,but no specific band was amplified from other subtypes of AIV or other ian pathogenic virus.The limit of detection for H9 and H10 subtype ian influenza virus was 5×104 copies/μL.The detection results of duplex RTPCR assay for clinical samples were the same as that of viral isolation（100%）.[Conclusion]This duplex RTPCR assay was a specific and sensitive method for the detection of H9 and H10 subtypes of AIV,which could provide technical support for the monitoring of H9 and H10 subtypes of AIV.
Key words Avian influenza virus;H9 subtype;H10 subtype;Duplex RTPCR
禽流感病毒（ian influenza virus,AIV）是正黏病毒科中A型流感病毒属成员.根据其表面抗原血凝素蛋白（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶蛋白（neuraminidase,NA）的差异可以将AIV划分为16种不同的HA亚型（H1～H16）和9种不同的NA亚型（N1～N9）[1-3].H9亚型AIV自1966年在美国首次被发现,目前已经给全球养禽业造成了十分严重的经济损失[4].自1998年广东首次发现人感染H9N2亚型AIV病例以来,H9N2型AIV感染人事件也在不断发生[5].H10亚型AIV主要在北美地区的鸡、火鸡、野鸟及南非地区的鸭中分离到病毒[6],近年来在我国华南地区的环境及家禽拭子样品中也有分离到H10亚型禽流感毒株的报道[7-8].在2004年和2010年,埃及和澳大利亚分别出现H10亚型AIV感染人事件[9].自2013年12月以来,我国先后发生3例人感染H10N8亚型禽流感病毒的病例并造成其中2人死亡,这是世界上首次报道H10亚型流感病毒感染人并致死的病例[10].近年来低致病性禽流感的流行病学监测中发现H9和H10亚型禽流感病毒混合感染普遍存在,研究还表明感染人的H10N8亚型流感病毒的部分内部基因来源于H9N2亚型AIV[11].因此,H9与H10亚型AIV对家禽养殖及人类健康卫生具有重要意义.
由于经典的病毒分离鉴定方法存在检测鉴定周期较长且需要进一步的血清学及分子生物学方法鉴定,而常用的血清学方法则需要较多标准阳性血清且不同亚型血清之间存在不同程度的交叉反应,具有一定的局限性,所以目前检测禽流感病毒主要采用分子生物学方法[12].分子生物學方法特别是PCR检测方法具有操作简便、特异性好、敏感性高等优点,在禽流感病毒的监测和诊断过程中得到了广泛应用[13].由于AIV混合感染普遍存在且具有相似的临床症状,难以及时准确地对其进行鉴别区分.近年来,多重PCR技术在禽流感诊断中的应用越来越多,但关于H9与H10亚型AIV混合感染的多重PCR检测方法还未见报道.笔者建立了一种可同时检测H9与H10亚型AIV的二重RT-PCR检测方法,不仅可以快速准确的鉴别2种不同亚型AIV,而且可为感染人的AIV病原学监测提供技术支撑.
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 毒株.AIV毒株（H1N2、H3N2、H6N2、H9N2、H9N6、NDV、IBV、MG、ARV、MG及ILTV均由广西兽医生物技术重点实验室保存;AIV（H7N2、H14N5、H15N9和H16N3）的cDNA 模板由美国宾夕法尼亚州立大学惠赠;AIV毒株（H5N1、H5N2、H5N7和H5N9）cDNA 模板均由美国康涅狄格州立大学惠赠;其他AIV毒株（H2N3、H4N5、H5N1、H7N9、H8N4、H10N3、H11N3、H12N5和H13N5）毒株或cDNA 模板均由香港大学惠赠.
1.1.2 试剂.增殖病毒所用SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司,DNA/RNA抽提试剂盒、PCR Mix、琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNA Marker DL 1 000、快速连接载体及质粒抽提试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司.MLV逆转录酶、10 mmol dNTP、感受态细胞及RNA抑制剂均购自宝生物（大连）有限公司.
1.2 方法
1.2.1 引物的设计及合成.从GenBank数据库中下载H9和H10亚型AIV的HA基因序列,使用DNAStar软件对上述序列进行比对分析,找出特异性的保守区域,然后使用Primer Premier 5.0软件结合Oligo7分析软件,设计并通过验证筛选出2对针对H9和H10亚型AIV HA基因进行扩增的特异性引物.引物由宝生物（大连）有限公司进行合成.引物序列及目的片段大小见表1.
1.2.2 病原RNA/DNA的提取与cDNA合成.参照核酸抽提试剂盒使用说明书对该研究中所用到的AIV、IBV、NDV和ARV的RNA及ILTV和MG的DNA进行抽提,抽提后的核酸模板用33 μL RNAfree水溶解.RNA模板参照宝生物反转录试剂盒的说明书进行cDNA的合成,所有核酸模板均置于-30 ℃下低温保存备用.
1.2.3 二重RT-PCR反应体系的建立及优化.该方法运用20 μL反应体系：2×PCR Mix 10 μL,H9与H10亚型AIV cDNA模板各1 μL,引物H9-F、H9-R、H10-F和H10-R （25 pmol/μL）分别加入0.1～1.0 μL,共10个梯度,每个梯度递增0.1 μL,进行2个引物组合浓度的优化,最后用RNAfree补足至20 μL.同时,根据引物各浓度梯度的试验效果,再对退火温度及反应时间进行组合优化,最终确定该方法的最佳反应体系及条件.
1.2.4 特异性试验.运用上述所建立的二重RT-PCR检测方法按照对H1N2、H2N3、H3N2、H4N5、H5N1、H6N2、H7N9、H8N4、H11N3、H12N5、H13N5、H14N1、H15N5、NDV、ARV、IBV、ILTV和MG的cDNA/DNA进行检测,验证所建方法的特异性.
1.2.5 标准品的制备.参考文献[14]中HA全长基因的引物,分别以H9N2与H10N3毒株cDNA为模板进行HA基因RT-PCR的扩增,得到其全长目的片段,并将目的片段分别连接到载体上并送交华大基因公司进行测序.将插入有H9与H10亚型AIV的HA基因全长片段并测序正确的重组质粒分别命名为H9-T和H10-T.用商品化的质粒抽提试剂盒分别提取含有H9-T和H10-T的质粒,并使用微量核酸检测仪对其浓度进行测定,按照相关公式计算样品相对应的拷贝数,同时将H9-T与H10-T质粒等拷贝数混合,并将混合好的样品进行10倍倍比稀释,以便获得H9-T与H10-T 质粒DNA浓度为5×101～5×109拷贝/μL的标准品.
1.2.6 敏感性试验.运用上述优化好的二重RT-PCR检测方法对制备的质粒DNA浓度5×101～5×109拷贝/μL的H9-T与H10-T质粒样品进行扩增,验证该检测方法的敏感性.
1.2.7 临床样品检测.运用试验所建立的二重PCR检测方法对近期从活禽市场采集的120份鸡和鸭咽喉及泄殖腔棉拭子样品一部分进行PCR检测鉴定,同时将相同编号剩余样品经过处理后接种SPF鸡胚进行流感病毒的分离与鉴定,并将H9与H10亚型AIV鉴定为阳性的样品进行HA基因测定.然后,将上述2种方法的结果进行比较,进而验证二重RT-PCR检测结果的准确性.
2 结果与分析
2.1 二重RT-PCR反应条件的优化 对H9与H10亚型AIV HA基因2对特异性引物浓度比例及扩增温度时间等的优化,确定二重RT-PCR反应的最佳体系：2×PCR Mix 12.5 μL,H9与H10亚型AIV 2 μL作为模板,特异性引物H9-F和H9-R（20 pmol/μL）的加入量为0.75 μL,特异性引物H10-F及H10-R（20 pmol/μL）的添加量为1 μL,用RNA-free水补足,使终体积至20 μL.通过对退火温度进行梯度优化筛选,确定该反应体系的最佳退火温度为53 ℃.
2.2 特异性试验
用所建立的二重RT-PCR法从H9及H10亚型AIV混合样品分别检测出2条特异性的条带,分别为490 bp（H9亚型）及272 bp（H10亚型）;对H9N2和H9N6亚型AIV PCR检测的结果仅出现1条特异性条带,片段大小为490 bp;对H10N3亚型AIV进行扩增只检测出1条特异性条带,片段大小为272 bp;对其他亚型AIV和常见的禽病病原体均未扩增出任何条带,结果表明该方法具有良好的特异性.特异性结果見图1.
2.3 敏感性试验
运用该方法针对5×109～5×101拷贝/μL的H9与H10亚型的AIV 质粒模板进行扩增,结果显示对浓度为5×109～5×104拷贝/μL的H9与H10亚型的AIV均有2条明显的特异性扩增条带出现,片段大小分别为490和272 bp;对浓度等于或小于5×103拷贝/μL的H9与H10亚型AIV均无扩增条带（图2）.由此可见,该方法最低能检测到质粒模板量为5×104拷贝/μL的H9与H10亚型AIV.
2.4 臨床样品检测
运用建立的方法对分别从南宁地区不同活禽市场采集到的120份鸡和鸭咽喉及泄殖腔拭子样品进行PCR检测,样品检测的结果显示有6份样品为H9与H10亚型AIV混合感染阳性,阳性率为5%;21份样品能扩增出490 bp大小的目的条带,为H9Nx AIV;2份样品能扩增出272 bp大小的目的条带,为H10Nx AIV;部分临床样品PCR检测的结果见图3.上述检测结果与样品的病毒分离鉴定及其HA基因测序结果完全相符.
3 讨论
H9与H10亚型禽流感病毒均属于LPAIV.H9亚型AIV已成为我国家禽养殖场内流行的禽流感病毒的主要亚型,不仅给养禽业造成了严重的经济损失,而且自20世纪90年代以来H9N2亚型AIV直接感染人的事件也不断发生.H10亚型AIV对家禽虽然呈现低致病性,但已有报道国外出现过感染人的病例,2013年12月江西报道了首例人感染H10N8亚型AIV并出现致人死亡的病例.近年来,还有研究证实H9亚型LPAIV还可以为HPAIV的重组提供内部基因（包括H10N8亚型AIV）[15-16],这些“新毒株”已经对人类公共卫生的安全构成了严重威胁,从而引发了科学家对H9与H10亚型AIV的广泛关注和深入研究.
近年来,笔者所在实验室对广西地区家禽中LPAIV流行情况进行持续监测,发现家禽中感染H9亚型LPAIV的比例较高,H10亚型AIV也时常被检测到,这与赵坤坤等[14]、Luo等[17]和Peng等[18]对华东地区不同亚型LPAIV的监测结果基本一致.由于很多亚型的LPAIV在家禽体内经常是以混合感染的形式存在,它们对家禽不产生明显的临床症状,难以靠肉眼和常规的方法进行快速的鉴别诊断.H9与H10亚型AIV不仅在家禽中普遍流行,而且严重威胁人类健康,其在家禽中混合感染的情况也比较常见.目前,对于H9与H10亚型AIV的混合感染迫切需要建立一种能够在较短时间内快速检测及鉴别H9与H10亚型AIV的方法,为2种亚型AIV的鉴别及LPAIV流行病学的监测提供可靠的技术支撑.
该研究通过设计针对H9与H10亚型AIV HA基因的特异性引物,经过对不同引物组合的筛选得到扩增效果的一个引物组合,然后继续对其引物浓度、退火温度和扩增时间进行优化,最终建立可同时检测H9与H10亚型AIV的方法.特异性和敏感性试验结果表明,该方法只能扩增出H9与H10亚型AIV HA基因,不能检测出其他亚型AIV及常见家禽病原的核酸,最低能检测到量为5×104拷贝/μL质粒模板,另外临床样品的检测结果也表明其与病毒分离结果完全相符.综上所述,该研究成功建立了能同时检测H9与H10亚型AIV二重RT-PCR方法,该方法具有特异性强及灵敏度高、方便和快速等优点,一次PCR反应便可确定H9与H10 亚型AIV的混合感染及单一感染情况,方便基层单位应用,为H9与H10亚型AIV的快速鉴别诊断提供有效的技术支撑.
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禽流感和二重引用文献:
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[2] 禽流感的免疫学检测方法论文
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