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除草剂玉米论文范文

摘要：从甲磺隆抗性结缕草植株中克隆得到乙酰乳酸合成酶基因（ＡＬＳ）,构建３５Ｓ启动子驱动的该基因的植物表达载体ｐ３３－ＡＬＳ.用农杆菌介导的玉米萌动胚转化方法转化玉米种子,获得抗除草剂的转ＡＬＳ基因玉米材料.结果表明,经除草剂筛选共获得抗性植株７株,阳性率为１．４％,Ｔ１代植株除草剂抗性试验表明,转基因植株能够耐受住５％的甲磺隆溶液喷洒.分离得到的ＡＬＳ基因导入玉米基因组后能够极大地提高对甲磺隆的耐受能力.

关键词：玉米；萌动胚；农杆菌；遗传转化

中图分类号：Ｓ５１３；Ｑ７８５文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０14）17－4001-04

Ｇｅｎｅｒａｔｉng ＨｅｒｂｉｃｉｄｅＲｅｓｉｓｔａｎｔＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＰｌａｎｔｓｉｎＭａｉｚｅ with

ＧｅｒｍｉｎａｔｉｎｇＥｍｂｒｙｏａｓＥｘｐｌａｎｔｓ

ＺＨＯＮＧＹｉ１, ＷＡＮＧＹｕｎ－ｐｅｎｇ２, ＤＡＩＸｉｕ－ｙｕｎ１, ＬＩＵＷｅｎ－ｇｕｏ２

（１．ＭａｉｚｅＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ, ＪｉｌｉｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ, Ｇｏｎｇｚｈｕｌｉｎｇ１３６１００, Ｊｉｌｉｎ, Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ, ＪｉｌｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ, Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３０１１８, Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Tｈｅｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐ３３-ＡＬＳ driven by ３５S ｐｒｏｍｏｔｅｒ was constructed ｆｒｏｍｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆａｓｈｏｒｔｃｙｃｌｉｎｇｚｏｙｓｉａｐｌａｎｔｓ originated ｆｒｏｍｃｌｏｎｉｎｇＡＬＳｇｅｎｅ． TｈｅｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄｍａｉｚｅｗｉｔｈｈｅｒｂｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＡLS ｇｅｎｅ was obtained with ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｔｉｒｒｉｎｇｏｆｍａｉｚｅｅｍｂｒｙｏｉｎｔｏｍａｉｚｅｓｅｅｄｓ. Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｏｆｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔ７ｐｌａｎｔｓｆｉｌｔｒａｔｅｄｂｙｗａｙｏｆｈｅｒｂｉｃｉｄｅ was １．４％. Hｅｒｂｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ of ｔｈｅＴ１ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｌａｎｔｓｈｏｗed ｔｈａｔｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｔｏｌｅｒａｔｅd ａｓｏｌｕｔｉｏｎｓｐｒａｙｗｉｔｈ５％ｍｅｔｓｕｌｆｕｒｏｎ－ｍｅｔｈｙｌ．ＴｈｅＡＬＳｇｅｎｅ isolated ｆｒｏｍｔｈｉｓｓｔｕｄｙａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｉｎｔｏｍａｉｚｅｇｅｎｏｍｅｃａｎｇｒｅａｔｌｙｉｍｐｒｏｖｅ maize ｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｍｅｔｓｕｌｆｕｒｏｎ－ｍｅｔｈｙｌ．

玉米田除草剂:玉米咋不长个都是除草剂惹的祸？

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍａｉｚｅ；ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇｅｍｂｒｙｏ； aｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ；ｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ

杂草是危害农作物的主要生物胁迫之一,尽管其对玉米生长中后期不再产生影响,但早期仍需要进行除草.除草剂是玉米除草十分理想的选择,尽管已有玉米专用性除草剂出现,但是对于多数单子叶杂草,其效果仍不理想,并且与草丁膦抗性相关的ｂａｒ基因、与草甘膦抗性的ＥＰＳＰＳ基因等许多除草剂基因均已被国外育种公司注册并取得了专利保护,成为我国育种过程中进一步应用的障碍.乙酰乳酸合成酶（ＡＬＳ）是植物和微生物中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸合成途径的第一种酶,不同的ＡＬＳ的氨基酸序列的差异与磺酰脲类除草剂抗性具有很大的关系,多数植物的ＡＬＳ对磺酰脲类除草剂较为敏感,目前已在拟南芥、细菌等中对此基因进行了克隆并对氨基酸序列和除草剂抗性的关系进行了研究［１,２］,但相关的专利保护不像ｂａｒ基因、ＥＰＳＰＳ基因那样苛刻.

利用农杆菌侵染及基因论文范文轰击等方法对玉米不同来源的外植体,诸如悬浮细胞［３］、幼胚［４］、幼穗［５,６］、茎尖［７-９］、成熟胚［１０,１１］等进行遗传转化.这些转化方法往往需要消耗大量人力物力并有一定的基因型依赖性.由于适合进行组织培养的基因型不具备较好的农业性状,因此给进一步的转基因玉米新品种选育工作带来较多阻碍.利用农杆菌介导玉米萌动胚［１２,１３］能够较好地解决这一问题,因此适合针对农艺性状好但组织培养体系尚未建立的玉米自交系的遗传转化工作.本研究利用农杆菌介导方法转化玉米萌动胚的方法将克隆的ＡＬＳ基因转化到玉米基因组中,分析转基因后对除草剂甲磺隆的抗性,为创建抗除草剂转基因玉米新品种打下基础.

１材料与方法

１．１试验材料

植物材料：ＪＶＯ１６为吉林省农业科学院玉米研究所实验室保存.结缕草（ＺｏｙｓｉａｊａｐｏｎｉｃａＳｔｅｕｄ．）种子购自花卉市场.

菌种质粒：质粒ｐＣＡＭＢＩＡ３３００、农杆菌ＥＨＡ１０５为吉林省农业科学院玉米研究所实验室保存.

试验药品：限制性内切酶、连接酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司,ＴｒａｎｓＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙ（ＨｉＦｉ）Ｔａｑ酶购自北京全式金生物工程公司,胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司.２００ｂｐｌａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ购自加拿大ＭＢＩ公司.

１．２试验方法

１．２．１抗甲磺隆ＡLS基因的获得取１０００粒野生型结缕草种子种植于花盆中,待植株生长至１０ｃｍ时喷洒１％甲磺隆溶液.取存活下来的植株,通过ＣＴＡＢ法提取植物总ＤＮＡ.根据ＮＣＢＩ上已知的ＡＬＳ基因序列设计引物Ｐｒｉｍｅｒ１、Ｐｒｉｍｅｒ２,通过ＰＣＲ扩增获得ＡＬＳ基因.模板用根据已发表的ＰＲ１０ａ启动子序列（ＧｅｎｂａｎｋＡＢ５１３３３１．１）设计的引物扩增.引物序列为：

Ｐｒｉｍｅｒ１：５′－ＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣＧＡＣＡＡＣ－３′

Ｐｒｉｍｅｒ２：５′－ＣＴＣＧＡＧＣＡＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＡＡＴＣＴＡＡＣ－３′

ＰＣＲ程序：９４ ℃ ５ｍｉｎ；９４ ℃ ３０ｓ,５８ ℃ ３０ｓ,７２ ℃ ２ｍｉｎ,３０个循环；７２ ℃ １０ｍｉｎ.ＰＣＲ产物连入TA克隆载体ｐＥＡＺＹ－Ｔ１,交由上海生工生物工程技术服务有限公司测序,并用ＤＮＡＭＡＮ和ＤＮＡＳＩＳ软件对其进行序列分析.

１．２．２植物表达载体的构建用ＸｈｏＩ将ｐＥＡＺＹ－ＡＬＳ上的ＡＬＳ基因切下,连接到用相同酶切的ｐ３３００大片段上,经ＸｈｏＩ酶切验证正确后,命名为ｐ３３－ＡＬＳ.

１．２．３转化和筛选挑选５００粒饱满、无损伤的玉米种子,经０．１％氯化汞浸泡消毒后,加入１５０ｍＬ无菌水,室温９０ｒ／ｍｉｎ振荡１２ｈ.将吸水膨胀种子进行划胚处理后,加入１５ｍＬＯＤ值为１的农杆菌菌液,共培养４８ｈ.将共培养后的种子播种在含有蛭石的营养土中,当玉米苗长至三叶一心期时,用０．５％的甲磺隆溶液喷洒筛选.筛选存活的玉米植株,经ＰＣＲ检测表现阳性的植株移至大盆,继续生长直至结实.

１．３ＰＣＲ检测

采用ＣＴＡＢ法提取６叶期除草剂抗性玉米的总ＤＮＡ,以此为模版进行ＰＣＲ扩增,检测ＡＬＳ基因是否插入玉米基因组中.ＡＬＳ基因检测用的引物序列如下：

Ｐｒｉｍｅｒ３：５′－ＧＧＡＧＴＧＡＣＧＴＴＧＧＧＧＣＡＴＣ－３′

Ｐｒｉｍｅｒ４：５′－ＡＣＴＣＧＴＧＴＧＡＣＧＧＣＡＧＧＡＣ－３′

预期扩增片段长度为５２６ｂｐ.

ＰＣＲ扩增总反应体系为２５ μＬ,其中２×ＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（北京天根生物技术有限公司）１２．５ μＬ,上下游引物各１ μＬ（１０ｎｍｏｌ/μL）,ＤＮＡ模板１ μＬ（１００ｎｇ/μL）,ｄｄＨ２Ｏ９．５ μＬ.ＰＣＲ扩增条件为：９４ ℃预变性５ｍｉｎ；之后９４ ℃变性３０ｓ,６０ ℃退火３０ｓ,７２ ℃延伸４５ｓ,共３０个循环；最终７２ ℃延伸８ｍｉｎ.试验以未转化植株的ＤＮＡ为阴性对照,以质粒ＤＮＡ为阳性对照,同时设立去离子水为模板的空白对照.ＰＣＲ扩增产物用１％琼脂糖凝胶电泳检测.

１．４除草剂抗性试验

将非转基因玉米和经过ＰＣＲ检测为阳性的玉米植株后代种植于土壤中,待长至三叶一心期时,用０．５％、１．０％、２．５％、５．０％的甲磺隆溶液喷洒筛选分析除草剂抗性.

２结果与分析

２．１片段的克隆与序列分析

ＰＣＲ产物经电泳检测,结果表明,成功获得了与目的基因大小相符的约为２ｋｂｐ的ＤＮＡ片段（图１Ａ）.片段插入ＴＡ克隆载体ｐＥＡＺＹ－Ｔ１后,命名为ｐＥＡＺＹ－ＡＬＳ.测序结果表明,ＰＣＲ扩增所获得的ＡＬＳ基因序列全长１９３８ｂｐ,与报道序列（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＡＢ５１３３３１．１）有３４个碱基的差异,同源性为９８．６％,所编码的氨基酸有３个位点发生了改变,经与除草剂敏感型水稻、除草剂抗性水稻的ＡＬＳ蛋白序列进行比较后发现,其中第５４９位、６２８位改变与其抗性产生相关,而第５５位氨基酸的差异仅为进化中产生的随机突变（图1B）.与玉米ＡＬＳ蛋白序列比较结果表明两者之间有８８．９％的同源性,而玉米内源的ＡＬＳ蛋白中第５４９位、第６２８位氨基酸与除草剂敏感型水稻一致,属于除草剂敏感型.为进一步进行遗传转化提高玉米除草剂抗性提供了依据.

２．２ｐ３３－ＡＬＳ植物表达载体的构建

如图２Ａ所示,通过亚克隆将ＡＬＳ基因替换ｐ３３００上的ｂａｒ基因.用ＸｈｏⅠ酶切ｐＥＡＺＹ－ＡＬＳ和ｐ３３００,分别回收ｐＥＡＺＹ－ＡＬＳ酶切产物中的小片段和ｐ３３００酶切产物中的大片段,用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接转化大肠杆菌.用ＸｈｏⅠ酶切鉴定释放出长约１．９８ｋｂｐ的片段（图２Ｂ）,最终经测序证实插入方向正确的重组载体命名为ｐ３３－ＡＬＳ.

２．３除草剂抗性植株的获得及ＰＣＲ检测

从图３Ａ所示的植物株中经过筛选共计获得抗除草剂玉米植株７株（图３Ｂ）,经ＰＣＲ扩增检测的结果如图３Ｃ所示,获得的７株抗性植株均为阳性植株,转化率为１．４％.

２．４除草剂抗性试验

经过不同的甲磺隆溶液喷洒１周后,０．５％甲磺隆溶液即可对野生型玉米植株产生影响,由图４可知,野生型植株在用５％甲磺隆溶液喷洒后１周即完全死亡,而Ｔ１代ＰＣＲ阳性的转基因植株几乎完全不受影响.

３结论与讨论

本研究分离得到的ＡＬＳ基因导入玉米基因组后能够极大地提高对甲磺隆的耐受能力.Ｔ１代的除草剂试验表明外援基因已整合到基因组中并能够顺利的遗传到后代.对该基因所编码的氨基酸序列进行分析发现,第５４９位Ｗ转变为Ｌ、第６２８位Ｓ转变为Ｉ,与水稻ＡＬＳ蛋白对甲磺隆抗性的突变结果一致,进一步证实了这两个位点与甲磺隆抗性相关,为进一步研究该基因功能提供佐证.

尽管利用植物组织培养等方法能够获得转基因植株,但是往往由于长时间的继代、筛选等过程导致再生植株出现各种非遗传方面的变异.而农杆菌介导的萌动胚转化法,集传统的农杆菌介导法和不依赖于组织培养转化法的优点于一身,是玉米转基因方法中优良的备选方案.因此,本试验选用了该方法作为创建转基因玉米种质的手段.

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玉米田除草剂引用文献: