简介:关于本文可作为相关专业蛋白肝素论文写作研究的大学硕士与本科毕业论文蛋白肝素论文开题报告范文和职称论文参考文献资料。
（农业部食品质量监督检验测试中心（上海）,上海市乳品质量监督检验站,上海 200436）
摘 要 采用高效液相色谱法建立了乳制品中乳铁蛋白测定的分析方法.试样中的乳铁蛋白经磷酸盐缓冲液提取,提取液经肝素亲和柱净化后,采用反相高效液相色谱柱分离,以二极管阵列检测器于280 nm处检测,采用外标法定量.结果表明：乳铁蛋白在10.0~1 000.0 ug/mL 范围内线性良好,添加回收率为75 %~110 %,相对标准偏差（RSD）小于20%.该方法具有灵敏度高、准确度高、重现性好的特点,适合检测机构或乳品企业日常样品中乳铁蛋白的检测.
关键词 乳铁蛋白；高效液相色谱法；肝素亲和柱
中图分类号 TS252.7 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）16-0291-02
乳铁蛋白是近年来国内外开发研究速度最快的一种营养添加剂,由于其具有广谱抗菌、抗病毒感染、调节体内铁平衡、调解骨髓细胞的生成、抑制人体肿瘤细胞、同多种抗生素及抗真菌制剂协同有效治疗疾病等功效,使其产品在国内外乳制品加工中的应用范围日益广泛[1-3].我国《食品营养强化剂使用标准（GB14880-2012）》中规定婴幼儿配方食品中乳铁蛋白的最大允许使用量为1.0 g/kg,而目前国内外未建立与乳制品中乳铁蛋白测定相关的国家标准.为保证乳铁蛋白的安全生产和使用,该文建立了乳制品中乳铁蛋白的检测方法,最大限度地保证市场中乳铁蛋白添加型产品的安全和质量水平,以保证乳制品安全,促进行业健康发展[4].
1. 材料与方法
1.1 供试材料、试剂与仪器
1.1.1 供试材料.供试材料为婴幼儿配方奶粉、婴幼儿配方米粉、成人配方奶粉.
1.1.2 试剂与仪器.Agilent 1200 高效液相色谱仪,配有二极管阵列检测器.肝素亲和柱（美国通用医药有限公司）.乙腈（色谱纯,美国Sigma公司产品）,无水乙醇、氯化钠、磷酸、磷酸氢二钠、三氟乙酸（分析级,国药集团化学试剂有限公司产品）.超纯水Nanopure Life Science（赛默飞世尔科技有限公司）.离心机Jouan Ceterifuge MR23i（赛默飞世尔科技有限公司）.
1.2 试验方法
1.2.1 提取试剂的选择.在相同试验条件下分别以水和磷酸缓冲液作为提取试剂,测定样品加标回收率,比较水和磷酸缓冲液对样品中乳铁蛋白的提取效果.
1.2.2 提取温度的选择.乳铁蛋白分子量为80 kDa,是具有大约700个氨基酸残基序列的单体糖蛋白,并连接1～2个配糖体.对于这一类大分子量的蛋白质,提取溶剂温度过高会造成乳铁蛋白结构的变化,致使检测结果偏离实际值.研究分别选取25、50、60、70、80、90 ℃进行比较.准确吸取1 mL 200 μg/mL的标准溶液于EP管中,分别于25、50、60、70、80、90 ℃下恒温水浴1 h,上机测定[5-6].
1.2.3 肝素亲和柱的选择.肝素（Heparin）是一种含硫酸酯的酸性多糖,有文献报道乳铁蛋白可与这类多负电荷分子糖胺多糖结合.故在该文中采用HiTrapTM Heparin HP（1 mL）肝素亲和柱作为目标化合物纯化和浓缩的前处理步骤.通过经过和未经过肝素亲和柱纯化的样品比较图,分析其对乳铁蛋白检测应用的可行性[7].
1.3 液相色谱条件
色谱柱：论文范文,5μm,300A（孔径）,250 mm×4.6 mm（内径）；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；进样体积：50 μL；流速：1.0 mL/min；流动相：0.1%三氟乙酸溶液和乙腈,梯度洗脱参数如表1所示.
1.4 样品前处理
1.4.1 提取.准确称取1 g试样（试样中含乳铁蛋白0.1～10.0 mg）于50 mL烧杯中,加入5 mL温热的磷酸氢二钠溶液（温度不超过50 ℃）,搅拌使样品完全溶解,将样品全部转入50 mL具塞塑料离心管中,再向原烧杯中加入5 mL磷酸氢二钠溶液,合并2次液体.漩涡振荡器振荡2 min,于室温下3 000 r/min离心10 min.将上层脂肪层和下层沉淀层之间的液体小心转移到另一个50 mL离心管中,再向原离心管中加入5 mL磷酸氢二钠溶液重复操作1次,合并2次液体作为样品提取液备用.
1.4.2 净化.肝素亲和层析柱先用5 mL磷酸氢二钠溶液平衡,处理完毕后加入样品提取液,待样品液体完全流出后,再用10 mL磷酸氢二钠溶液淋洗,弃去全部流出液.最后用3 mL磷酸氢二钠-氯化钠溶液洗脱,收集全部流出液,用磷酸氢二钠-氯化钠溶液定容至3 mL.将收集溶液过0.45 μm水相滤膜,供液相色谱-DAD检测分析用.
2. 结果与分析
2.1 提取试剂的选择
试验证明,在同样的试验条件下用磷酸缓冲液作为提取试剂的回收率比水作为提取试剂高50%.另外,样品中含有比较高浓度的蛋白类物质时,乳铁蛋白在磷酸盐缓冲液中的溶解度优于水中；后续试验采用肝素亲和的活化需要磷酸盐缓冲液；采用缓冲液作为提取试剂可以保证样品上柱前的pH值在试验要求范围.
2.2 提取温度的选择
试验数据表明,随着温度的上升,乳铁蛋白的结构发生了变化.从表2可知,目标峰的峰高由25 ℃的76.9降低至90 ℃的22.2.因此得出结论,为了保证试验结果的准确性,在乳铁蛋白提取过程中必须控制提取缓冲液的温度在50 ℃以下.
2.3 肝素亲和柱的选择
从图1可知,未经过肝素亲和柱纯化的样品成分比较复杂,给乳铁蛋白的检测造成了相当大的难度,经过肝素亲和柱纯化的样品,杂质就比较少,峰形比较好,符合检测的要求.
2.4 线性关系及方法检出限
用液相色谱法测定不同浓度的乳铁蛋白标准溶液,其测定结果表明乳铁蛋白的标准溶液与峰面积响应值之间存在着较好的线性关系,从表3、图2可知,相关系数R2为0.999 1,回归方程分别为y＝2.540 7x-13.275.
根据限量检测要求,对婴幼儿配方奶粉、婴幼儿配方米粉、成人配方奶粉等几类样品中乳铁蛋白进行了加标回收重复试验.根据信噪比S/N＝3,试验结果表明,该方法检出限均达到20 mg/100 g.
2.5 回收率的测定
应用该方法,添加标准物质,对婴幼儿配方奶粉、婴幼儿配方米粉、成人配方奶粉3类样品中进行乳铁蛋白回收率的测定,从表4可知,按已确定的样品提取条件和色谱条件测定添加回收量,试验表明平均回收率达到75%~100%,相对标准偏差<,15%,说明该方法对不同样品中、不同含量的乳铁蛋白的测定均有较好的准确度.
3. 结论与讨论
采用高效液相色谱法（HPLC）的方法测定乳制品中乳铁蛋白含量的测定.试样中的乳铁蛋白经磷酸盐缓冲液提取,提取液经HiTrapTM Heparin HP柱或相当者净化浓缩后,用反相高效液相色谱柱分离,于紫外检测器280 nm处检测,外标法定量.该方法与文献中报道的方法相比,具有操作方便简单、耗时较短、重复性好、回收率高、灵敏度高的优势.
肝素结合蛋白:欧阳娜娜 一个行走的胶原蛋白
4. 参考文献
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[3] VORLAND L H.Lactoferrin：a multifunctional glycoprotein.APMIS.1999, 107（7-12）：971-981.
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[6] 赵红宇,刘晓飞,周盛华,等.牛初乳中乳铁蛋白的分离纯化[J].农产品加工·学刊（下）,2013（5）：3-5.
[7] 孙晶,张昊,郭慧媛,等.乳铁蛋白抑菌功能的研究进展[J].中国乳业,2012（10）：38-41.
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肝素结合蛋白引用文献:
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